劉超武 續(xù)力云 陳軍 樂(lè)涵波

肺癌是全球癌癥死亡最主要的原因，其5年生存率僅15%，我國(guó)肺癌發(fā)病率每年增長(zhǎng)26.9%，占全部惡性腫瘤死亡的22.7%，且發(fā)病率和病死率仍在迅速上升。肺癌從組織學(xué)類(lèi)型上分為小細(xì)胞肺癌（small cell lungcancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC），其中約 80%為 NSCLC，包括腺癌（adenocarcinoma，ADC）、鱗癌（squamous cell carcinoma，SCC）和大細(xì)胞癌等，占比最多的是肺腺癌。本研究通過(guò)對(duì)比浸潤(rùn)性肺腺癌組織與癌旁組織差異表達(dá)基因，篩選及驗(yàn)證浸潤(rùn)性肺腺癌組織上調(diào)表達(dá)基因，尋找肺腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的新型分子標(biāo)記物，為進(jìn)一步探討肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2014年1月至2015年1月本院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的肺腺癌患者6例，制作癌組織及相應(yīng)癌旁組織基因表達(dá)譜芯片,其中男4例，女2例；年齡52～68，平均62.2歲；腫瘤最大徑1.5～5cm，平均2.6cm；有吸煙史4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1例；所有患者均無(wú)胸膜侵犯。另收集2015年1月至2016年6月本院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的肺腺癌組織樣本97例，上述6例樣本亦納入，共103例，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）擴(kuò)增目的基因，分析癌組織目的基因的表達(dá)情況，其中男36例，女 67 例；年齡 53～69（63.0±5.7）歲；腫瘤最大徑 1.5～5（2.54±1.34）cm；有吸煙史 20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 13例；胸膜侵犯19例；根據(jù)第7版肺癌TNM分期，Ⅰ期4例，Ⅱ期1例，Ⅲ期1例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病例均經(jīng)術(shù)后病理確診；術(shù)前未經(jīng)放化療治療；無(wú)明顯肝腎功能損害；術(shù)后臨床病理資料完整，包括性別、年齡、吸煙史、腫塊大小、病理類(lèi)型、轉(zhuǎn)移情況、分期；排除惡性腫瘤史及其他部位原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移病灶。按2011年肺腺癌新分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)2位病理醫(yī)生診斷均為浸潤(rùn)性肺腺癌。所有標(biāo)本另取相應(yīng)癌旁組織（切緣距腫塊2cm）作對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片 基因芯片制備委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。運(yùn)用表達(dá)譜芯片平臺(tái)制作6例浸潤(rùn)性肺腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織基因表達(dá)譜芯片。芯片的起始樣本為總RNA，采用專(zhuān)用于提取組織總RNA的Recover AllTMTotal Nucleic Acid Isolation（Cat#AM1975，Ambion，Austin，TX，美國(guó)）提取試劑盒，經(jīng)NanoDrop ND-2000 分光光度計(jì)及 Agilent Bioanalyzer2100（Agilent technologies，Santa Clara，CA，美國(guó)）進(jìn)行質(zhì)檢。每個(gè)樣本使用100ng總RNA，由小牛腸堿性磷酸酶在37℃條件下反應(yīng)30min進(jìn)行去磷酸化處理，15%濃度的二甲基亞砜（DMSO）使RNA變性后，通過(guò)T4-RNA連接酶（T4 RNA Ligase）連接標(biāo)記物Cyanine3-pCp，16℃條件下反應(yīng)2h。標(biāo)記后對(duì)樣本進(jìn)行干燥處理以去除殘余DMSO。準(zhǔn)備好10X阻斷劑。用無(wú)核酸酶的純水溶解干燥后的樣品，依次加入阻斷劑和雜交緩沖液，100℃5min后立即轉(zhuǎn)入冰上放置5min。將雜交樣品緩慢加入墊片的小室中，芯片反應(yīng)面向下蓋在墊片之上，蓋上并固定，同時(shí)避免氣泡產(chǎn)生，20r/min、55℃條件下雜交20h。雜交反應(yīng)后依次用基因表達(dá)清洗緩沖液清洗芯片，在基因表達(dá)清洗緩沖液中拆除雜交裝置，并將芯片放入基因表達(dá)清洗緩沖液中繼續(xù)清洗。盡快掃描芯片，以減少環(huán)境氧化劑對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的影響。Feature Extraction（FE）9.5.3軟件提取掃描結(jié)果。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 所有引物序列均引用于Pubmed、Nucletide Tools，其序列均來(lái)自各基因轉(zhuǎn)錄本的編碼序列（CDS），且所有引物設(shè)計(jì)條件均滿(mǎn)足以下條件：引物長(zhǎng)度17～25bp，GC含量保持在45%～55%，熔鏈溫度（Tm）為 60℃左右，A、C、G、T堿基分布均勻。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。本實(shí)驗(yàn)以短小桿菌RNA結(jié)合蛋白家族成員-1（PUM1）為內(nèi)參基因。引物序列如下引物（5′～3′）：PUM1，上游-GGCTTTGGCAGAACGGATTC，下游-TCTCATTCTGCTGGTCTGAAGG；SPINK1，上游-ATATGACCCTGTCTGTGGGAC，下游-CAGCAAGGCCCAGATTTTTGA；ITGA11，上游-ACCCAATCTGCACACTCCAG，下游-TGGGTTCATTCTTCGGGAGC；TOX3，上游-AGTGGCATAGGAGGGAAAAGC，下游-GACACTTGAGAGGACCGTTTGA；SPP1，上 游 -TGCTTCTTTCTCAGTTTATTGGTTG，下游-AGGGAGTTTCCATGAAGCCAC；MCM10，上游-CACCAGGTTGGTGTCTGAGC，下游-GCTCACCCTCAGCCTTTACA；MMP12，上游-AGTTACCTTCAAAGGCCAAGAGA，下游-AGTCCAAGGATGTTAGGAAGCA；FOXA1，上游-AAGTTACAAGGACCCCAACCC，下游-GAAGCAGAGTTCTTGAGGGCA；TMEM45B，上游-GGCACAGGTGTCCTGATGG，下游-GCGGGTACTTCACTGACCAA；SIX1，上-AAACCAACAGCGATCTCAAGC，下游-AACAGGCGTATCAGTTGCCC；CEACAM1， 上 游 -AGAACCAAAGCGACCCCATC，下游-TCATTGGAGTGGTCCTGCC；CYP2J2，上游-CTGCTCAGATGTGTTGGGACA，下游-ATTCGGACGAGACAGTAGAGC；GDF15， 上 游 -CTGAGACACCCGATTCCTGC， 下 游 -ACACAGTTCCATCAGACCAGC；CLIC6，上游-AGTGCTGGTGGTATCGTGTG，下游-ACTCCCTCCCTAACTGGACC；ESR1，上游-CAGCGACGACAAGTAAAGTGG，下游-TCCCAGATGCTTTGGTGTGG；COLLA1， 上 游 -GCACAGACGGAGATAAATGGC，下游-ATACCAGGCTCAACCACTGC。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 每一樣本組織均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，反應(yīng)體系：cDNA 溶液 1μl、SYBRPremix Ex TaqⅡ（2×）10μl、上游引物（10μM）0.8μl、下游引物（10μM）0.8μl、ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μl、DEPC 水 7μl，共20μl，配制過(guò)程均避光在冰上完成。應(yīng)用7500熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本取3個(gè)重復(fù)孔Ct值平均數(shù)。

1.2.4 觀(guān)察指標(biāo) 以PUM1為內(nèi)參基因，獲得各樣本組織ΔCt值（各目的基因Ct值-PUM1 Ct值），通過(guò)公式RQ=2-ΔCt計(jì)算肺腺癌組織RQC值及相應(yīng)癌旁組織RQN值。然后轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值log2RQ對(duì)肺腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織各目的基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。最后通過(guò)公式FC值=RQC/RQN得到肺腺癌組織相對(duì)于癌旁組織各目的基因FC值，并轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值log2FC以分析各目的基因在肺腺癌中表達(dá)水平。對(duì)于FC值≥2，即log2FC≥1，認(rèn)為該基因在肺腺癌組織表達(dá)上調(diào)；1/2＜FC值＜2，即-1＜log2FC＜1，認(rèn)為該基因在肺腺癌組織表達(dá)無(wú)變化；FC值≤1/2，即log2FC≤-1，認(rèn)為該基因在肺腺癌組織表達(dá)下調(diào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，肺腺癌組織與相應(yīng)癌旁組織各目的基因表達(dá)水平比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片初步篩選結(jié)果 通過(guò)Genespring軟件系統(tǒng)，結(jié)合SAM軟件分析方法，篩選在兩種軟件較高可信度范圍內(nèi)均為差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，在浸潤(rùn)性肺腺癌組織，共有1621個(gè)上調(diào)表達(dá)基因（P＜0.05），進(jìn)一步通過(guò) Gene ontology 、Pathway分析、標(biāo)記物預(yù)測(cè)分析和基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析方法對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)合The Lung Cancer數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與肺癌發(fā)生相關(guān)的mRNA信息，初步篩選出在浸潤(rùn)性肺腺癌組織14個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，詳見(jiàn)圖1、表1。

圖1 6例浸潤(rùn)性肺腺癌癌組織與癌旁組織基因表達(dá)主成分分析圖

由圖1可見(jiàn)，主成分1軸（Comp.1）上，癌旁組織樣本基因表達(dá)譜分布較集中（綠色點(diǎn)），波動(dòng)較小，即組內(nèi)差異較小；主成分2軸（Comp.2）上，各肺腺癌組織樣本基因表達(dá)譜所代表的點(diǎn)和各癌旁組織樣本基因表達(dá)譜所代表的點(diǎn)分別分布在兩個(gè)不同象限，無(wú)交叉現(xiàn)象，主成分分析圖表明基因芯片數(shù)據(jù)較可靠。

2.2 浸潤(rùn)性肺腺癌組織各目的基因mRNA表達(dá)水平分布圖 見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，以患者編號(hào)為橫坐標(biāo)，以mRNA在浸潤(rùn)性肺腺癌組織相對(duì)癌旁組織表達(dá)水平log2FC為縱坐標(biāo)，按log2FC從小到大排列獲得14個(gè)目的基因mRNA在肺腺癌組織表達(dá)水平柱形分布圖，結(jié)果表明，與相應(yīng)癌旁組織相比，SPINK1 mRNA、TOX3 mRNA、MMP12 mRNA、CLIC6 mRNA、TMEM45B mRNA 在浸潤(rùn)性肺腺癌組織表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而ITGA11 mRNA、SPP1 mRNA、MCM10 mRNA、COL11A1 mRNA、SIX1mRNA、FOXA1mRNA、GDF15mRNA、CEACAM1 mRNA、ESR1 mRNA在肺腺癌組織表達(dá)未見(jiàn)上調(diào)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 6例浸潤(rùn)性肺腺癌癌組織與癌旁組織差異表達(dá)基因列表（n=14）

圖2 浸潤(rùn)性肺腺癌組織各目的基因m R N A表達(dá)水平分布圖（橫坐標(biāo)為患者編號(hào)；縱坐標(biāo)為m R N A在浸潤(rùn)性肺腺癌組織相對(duì)癌旁組織表達(dá)水平l o g 2F C）

3 討論

目前，肺癌是人類(lèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中肺腺癌是肺癌最常見(jiàn)的病理類(lèi)型。由于肺癌的高度侵襲性及異質(zhì)性，多數(shù)肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)、血行或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是其預(yù)后較差的主要原因[11]。目前，影像學(xué)檢查是術(shù)前診斷肺腺癌的主要手段，但其缺乏特異性，且受接診醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)等主觀(guān)因素影響較大，仍存在較高的誤診及漏診率。腫瘤分子標(biāo)記物已逐漸被國(guó)內(nèi)外學(xué)者們所發(fā)現(xiàn)，對(duì)肺腺癌診斷、治療、預(yù)后評(píng)價(jià)等方面具有重要意義[12-14]。本研究從腫瘤分子標(biāo)記物思路出發(fā)，探討在浸潤(rùn)性肺腺癌組織中上調(diào)表達(dá)的mRNA分子，可能成為浸潤(rùn)性肺腺癌早期診斷的新方向。

本研究初期經(jīng)過(guò)基因芯片方法尋找浸潤(rùn)性肺腺癌組織與癌旁組織差異表達(dá)基因，共有14個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，分別為 SPINK1、ITGA11、TOX3、SPP1、MCM10、MMP12、COL11A1、SIX1、FOXA1、CLIC6、TMEM45B、GDF15、CEACAM1、ESR1，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量檢測(cè)浸潤(rùn)性肺腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織以上14個(gè)基因的表達(dá)情況，qPCR驗(yàn)證結(jié)果表明，與相應(yīng)癌旁組織相比，SPINK1 mRNA、TOX3 mRNA、MMP-12 mRNA、CLIC6 mRNA、TMEM45B mRNA在浸潤(rùn)性肺腺癌組織上調(diào)表達(dá)，而ITGA11 mRNA、SPP1 mRNA、MCM10 mRNA、COL11A1 mRNA、SIX1mRNA、FOXA1mRNA、GDF15mRNA、CEACAM1 mRNA、ESR1 mRNA在肺腺癌組織表達(dá)未見(jiàn)上調(diào)。

SPINK1又稱(chēng)胰腺分泌的胰蛋白酶抑制劑或腫瘤相關(guān)胰蛋白酶抑制劑（tumor-associated trypsin inhibitor，TATI）[15]，在正常情況下表達(dá)產(chǎn)生一種胰酶抑制劑，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式抑制胰蛋白酶分泌，防止自身“過(guò)度消化”?，F(xiàn)已被證實(shí)在多種癌癥，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌中異常表達(dá)[16-18]，且其高表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但在肺腺癌中異常表達(dá)報(bào)道較少。Kati等[19]指出，SPINK1參與了多種生理過(guò)程，同時(shí)也作為一種急性期反應(yīng)物，抑制細(xì)胞凋亡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，并可能成為腫瘤的治療靶點(diǎn)。Lazar等[20]認(rèn)為SPINK1可能可以為肺癌的早期診斷提供依據(jù)，尤其是鑒別鱗癌與腺癌。Pallante[22]也認(rèn)為SPINK1通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和組織修復(fù)，間接地參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展，其過(guò)度表達(dá)常常提示不良的預(yù)后。

TOX3是TOX家族的一員，主要在發(fā)育中的小鼠腦中表達(dá)，在胚胎E14期達(dá)到一個(gè)峰值。與乳腺癌的發(fā)生有很強(qiáng)的相關(guān)性，其表達(dá)水平在乳腺癌組織中增加。Mathewos等[23]認(rèn)為T(mén)OX3具有滅活靶向神經(jīng)元發(fā)育的功能，TOX3甲基化在肺癌患者中比較普遍，其在正常肺組織中也可表達(dá)，但在肺腫瘤患者的組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且在鱗癌患者中表達(dá)更高。Jiang等[24]也發(fā)現(xiàn)TOX3的存在可能增加肺癌發(fā)生的概率，并且在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。

MMP-12表達(dá)產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶是一類(lèi)具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，通過(guò)降解細(xì)胞外膠原蛋白及基底膜成分使惡性腫瘤細(xì)胞向相鄰周?chē)M織浸潤(rùn)、遷移及轉(zhuǎn)移。Wang等[25]通過(guò)研究軟骨肉瘤的侵襲信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)MMP-12與SCLC患者的局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。目前，MMP-12 mRNA已被證實(shí)在肺癌、肝癌、大腸癌、外陰癌和胰腺癌等諸多癌癥癌組織中有表達(dá)[26]。Hofmann等[26]報(bào)道MMP-12 mRNA的表達(dá)能較好地預(yù)測(cè)SCLC早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。Lv等[27]通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)研究也證實(shí)，MMP-12的高表達(dá)與肺腺癌患者的病理分期和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，敲除MMP-12基因可抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)，表明MMP-12可能是治療肺腺癌的治療靶點(diǎn)。Tian等[28]應(yīng)用qRT-PCR的方法檢測(cè)NSCLC患者癌組織及癌旁組織差異表達(dá)的基因，結(jié)果表明MMP-12可能可以參與SCLC的發(fā)生、發(fā)展，并且可以用作SCLC的潛在標(biāo)記物或治療靶標(biāo)。然而，MMP-12 mRNA表達(dá)在浸潤(rùn)性肺腺癌癌組織與癌旁組織是否存在差異鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)熒光定量PCR的方法檢測(cè)浸潤(rùn)性肺腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織MMP-12 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示MMP-12 mRNA水平在浸潤(rùn)性肺腺癌組織上調(diào)表達(dá)，提示可作為肺腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的新型分子標(biāo)記物。

細(xì)胞內(nèi)氯離子通道家族（CLIC）在人類(lèi)中由6個(gè)保守蛋白組成，這些保守蛋白是一組神經(jīng)蛋白，采用可溶性的方式與膜結(jié)合[29]。細(xì)胞內(nèi)氯離子通道-6（CLIC-6）是家族中的一員，Achim Bell等[30]發(fā)現(xiàn)CLIC-6的下調(diào)與腺樣囊性癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性。Yan等[31]研究了CLIC6在人類(lèi)甲狀腺中的表達(dá)，結(jié)果表明，CLIC6可能在甲狀腺功能中發(fā)揮作用，其可能與家族性甲狀腺腫的遺傳異質(zhì)性有關(guān)。目前很少有文獻(xiàn)報(bào)道CLIC6在肺腺癌中的表達(dá)和作用，表明CLIC6可能成為診斷肺腺癌的一個(gè)新的方向。

TMEM45B，即跨膜蛋白45B，已在多種人類(lèi)癌癥中觀(guān)察到TMEM表達(dá)的改變，但是很少有報(bào)道TMEM45B在肺癌中的表達(dá)和作用。Hu等[32]使用癌癥基因組圖譜重新分析和評(píng)估TMEM45B在肺癌組織中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TMEM45B在肺癌中過(guò)度表達(dá)，且其表達(dá)與患者的總生存相關(guān)，提示TMEM45B是肺癌中潛在的預(yù)后標(biāo)記物和治療靶標(biāo)。Zhao等[33]也提出TMEM45B在SCLC的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要的角色，提示其可能成為肺癌的新型標(biāo)記物。Molina-Pinelo等[34]進(jìn)一步研究了肺腺癌患者和肺鱗癌患者組織中TMEM45B的表達(dá)差異，結(jié)果顯示TMEM45B在肺鱗癌患者癌組織中的表達(dá)明顯少于肺腺癌患者，提示TMEM45B可能與不同肺癌病理之間的相關(guān)性。

綜上所述，與相應(yīng)癌旁組織相比，SPINK1 mRNA、TOX3 mRNA、MMP-12 mRNA、CLIC6 mRNA、TMEM45B mRNA在浸潤(rùn)性肺腺癌組織上調(diào)表達(dá)，提示可能對(duì)浸潤(rùn)性肺腺癌診斷及治療具有重要意義，但以上基因在浸潤(rùn)性肺腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。由于本研究病例數(shù)少，仍需更多樣本量對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

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