楊敏 楊立軒 韋妮 馮潔 郭子鵬 凌秀孟 莫庸 韋金花 王俐 謝尤祥 馮雪萍

【摘要】?目的?探討紅薯葉總黃酮對(duì)小鼠急性腦缺血缺氧的作用。方法?制備紅薯葉總黃酮溶液，通過(guò)飽和MgCl2致小鼠急性腦缺血實(shí)驗(yàn)、NaNO2中毒性缺氧實(shí)驗(yàn)、常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)和小鼠斷頭實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)急性腦缺血缺氧小鼠腦組織中總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和丙二醛 （MDA）含量變化。結(jié)果?與正常對(duì)照組比較，各給藥組小鼠的存活時(shí)間均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）;各給藥組腦指數(shù)和MDA含量均下降，T-SOD活性提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論?紅薯葉總黃酮溶液對(duì)腦缺血缺氧損傷有一定的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】?紅薯葉總黃酮;腦缺血缺氧;小鼠;保護(hù)作用

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.06.002

紅薯味甘，性平，具有補(bǔ)中、益氣、健脾、通便等多種功效，是我國(guó)主要農(nóng)作物之一。現(xiàn)代科學(xué)研究表明紅薯莖、葉中富含各種化學(xué)成分，其提取物具有廣泛的醫(yī)療和保健作用。目前，對(duì)紅薯葉的研究主要集中在其提取物黃酮化合物及其功能、活性多糖及其功能和紅薯葉作為保健食品的開(kāi)發(fā)利用等方面。研究證實(shí)，紅薯葉黃酮化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抗菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射、治療腹瀉等多重作用[1]?！八幨惩础笔侵嗅t(yī)推崇的疾病防治方法，經(jīng)常食用紅薯葉有美容護(hù)膚，延年益壽的功效，在歐美、日本等國(guó)家及香港地區(qū)掀起一股“紅薯葉熱”，而在國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)紅薯葉卻被廢棄或作為動(dòng)物飼料，沒(méi)有得到充分的利用。因此，對(duì)紅薯葉進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用具有廣闊的市場(chǎng)前景[2]。目前為止尚未發(fā)現(xiàn)紅薯葉總黃酮對(duì)缺血性腦血管疾病的相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建四個(gè)經(jīng)典小鼠急性腦缺血缺氧模型，觀察紅薯葉總黃酮對(duì)腦缺血缺氧的保護(hù)作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制，為紅薯葉的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1?儀器

KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器、電熱恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FSH-2A可調(diào)高速電動(dòng)勻漿機(jī)、高速臺(tái)式離心機(jī)、722型分光光度計(jì)、FA（N）/JA（N）電子天平。

1.1.2?動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠120只[由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（桂）2017-2003，使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2017-0004]，雄雌各半，體重（20±2）g。小鼠在正式實(shí)驗(yàn)前均在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由采食和飲水。

1.1.3?藥品

紅薯葉（采摘于廣西百色市）;尼莫地平片（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：B160309015）;乙醇（分析純，生產(chǎn)批號(hào)：20170115，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）;鈉石灰（生產(chǎn)批號(hào)：20170210，上海納輝干燥試劑廠）;總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20170809）、丙二醛 （MDA）測(cè)定試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20170806）和總蛋白測(cè)定試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20170809），均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1?紅薯葉總黃酮的制備

（1）提?。翰杉迈r的紅薯葉去雜、清水漂洗并瀝干其表面水分，（80±1）℃鼓風(fēng)干燥72 h以上，冷卻后粉碎，過(guò)40目篩后，置干燥器備用。精密稱(chēng)取紅薯葉粉末200 g，加2000 mL 70%乙醇，密閉浸泡過(guò)夜，超聲波提取2.5 h，抽濾。濾渣再加1500 mL 70%乙醇，超聲波提取1.5 h，抽濾，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后用乙酸乙酯萃取3次，真空干燥，得到紅薯葉粗制總黃酮粉末。（2）純化：將提取得到的粗黃酮化合物在AB8大孔樹(shù)脂柱上進(jìn)行純化，用500 mL 60%乙醇洗脫，收集乙醇部分，減壓濃縮，在冷凍機(jī)中干燥得到純化黃酮。（3）鑒定：將純化后得到的總黃酮取少量溶于1 mL甲醇溶液試管中，加入濃鹽酸2～3滴，再加少量鎂粉，觀察到玫瑰紅色即可確定為紅薯葉總黃酮。（4）含量的測(cè)定：采用以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品的比色法測(cè)定總黃酮含量。

1.2.2?小鼠急性腦缺血實(shí)驗(yàn)[3]

1.2.2.1?飽和MgCl2致小鼠急性腦缺血實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，隨機(jī)分成三組：空白組、總黃酮提取組、尼莫地平組;每天灌胃，紅薯葉總黃酮提取組和尼莫地平組的給藥劑量分別為200 mg·kg-1、18 mg·kg-1，空白組用等量生理鹽水灌胃，連續(xù)7天，末次給藥1 h后，小鼠尾靜脈注射飽和MgCl2溶液（0.1 mL·10 g-1），記錄存活時(shí)間為從注射藥品至最后一次張口喘息的時(shí)間。

1.2.2.2?4%NaNO2溶液腹腔注射所致小鼠中毒性缺氧實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，分組及給藥方法同1.2.2.1，NaNO2給藥劑量為（0.1 mL·10 g-1）

1.2.2.3?常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，分組及給藥方法同1.2.2.1，末次給藥1 h后，將小鼠放入裝有20 g鈉石灰的150 mL的帶塞的廣口瓶中，記錄小鼠從放入瓶中至停止呼吸的時(shí)間。

1.2.2.4?小鼠斷頭實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)昆明小鼠30只，雌雄各半，體重（20±2）g，分組與操作方法同1.2.2.1，末次給藥前稱(chēng)重，給藥后1 h，迅速?gòu)男∈蠖箢i部斷頭，記錄小鼠張口喘息次數(shù)和喘息維持的時(shí)間，然后冰上取全腦，計(jì)算腦指數(shù)。再用9倍4 ℃生理鹽水將腦組織勻漿，制成10%勻漿液，離心取上清4 ℃保持備用。

1.2.3?小鼠腦組織中T-SOD和MDA的含量測(cè)定

取制備好的腦組織勻漿，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，運(yùn)用單因素方差分析（LSD 法）進(jìn)行組間比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2?結(jié)果

2.1?總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶于100 mL 60%乙醇，分別精密吸取蘆丁對(duì)照液（0.10 mg·mL-1）0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10.00 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min;再加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min;再加4%氫氧化鈉溶液4.00 mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置12 min，以試劑作空白參比液，于510 nm處測(cè)吸光度[4]。以蘆丁濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁溶液濃度（Y）與吸光度值（A）關(guān)系曲線的回歸方程式：Y=0.1468X+0.0019，絕對(duì)系數(shù) R2=0.999。

2.1.2?樣品含量的測(cè)定

精密稱(chēng)取樣品總黃酮10 mg，溶于100 mL 60%乙醇，吸取樣品液1 mL，置10 mL容量瓶，60%乙醇補(bǔ)足至刻度，測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮的含量為0.5 mg/mL。

2.2?紅薯葉總黃酮對(duì)3種模型小鼠耐缺氧存活時(shí)間的影響

由表1可知，與正常對(duì)照組相比，尼莫地平組和總黃酮提取組均能延長(zhǎng)飽和MgCl2致小鼠急性腦缺血的存活時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），也能延長(zhǎng)NaNO2所致小鼠中毒性缺氧的存活時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;兩個(gè)給藥組均能顯著延長(zhǎng)小鼠常壓耐缺氧的存活時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）;尼莫地平組與總黃酮提取組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3?紅薯葉總黃酮對(duì)小鼠斷頭喘息的影響

由表2可知，與正常對(duì)照組比較，各給藥組均能增加小鼠斷頭后的喘息次數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），延長(zhǎng)小鼠斷頭后的喘息維持時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;尼莫地平組與總黃酮提取組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4?紅薯葉總黃酮對(duì)急性全腦缺血缺氧小鼠腦指數(shù)及T-SOD和MDA含量的影響

由表3可知，與正常對(duì)照組比較，各給藥組腦指數(shù)和MDA含量均顯著下降，SOD活性顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;尼莫地平組與總黃酮提取組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3?討論

缺血性腦血管病是危害人類(lèi)健康的疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)[5]，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，難治愈，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。在腦組織發(fā)生缺血和缺氧的情況下，腦細(xì)胞會(huì)釋放大量的炎癥因子、興奮性氨基酸參與組織損傷過(guò)程，從而誘發(fā)腦功能障礙疾病[6]。腦缺血缺氧是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，需及時(shí)進(jìn)行治療，否則會(huì)導(dǎo)致腦損傷加重甚至死亡。目前治療缺血性腦損傷，主要是從抗谷氨酸受體、抗鈣超載、抗自由基這些途徑入手，至今尚無(wú)有效的治療方法[7]。腦缺血缺氧損傷是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其損傷機(jī)制主要與自由基生成增多等因素有關(guān)[8]。已證實(shí)紅薯葉黃酮類(lèi)化合物是一種很好的自由基清除劑[9]，可以提高老齡糖尿病大鼠的免疫力[10];改善模型動(dòng)物體重，顯著降低內(nèi)臟脂肪含量和空腹血漿胰島素水平，對(duì)非胰島素依賴(lài)型糖尿病小鼠具有降低血糖、血脂和增加抗氧化性的功能[11]，還可以改善糖尿病小鼠腎臟的損傷，對(duì)腎細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用[12]。

當(dāng)腦組織由于各種原因?qū)е氯毖毖鯐r(shí)，就會(huì)產(chǎn)生大量炎癥因子，引起腦水腫，進(jìn)而弱化血腦屏障功能，加速炎癥因子進(jìn)入腦組織，加劇對(duì)腦部的損傷[13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)幾個(gè)經(jīng)典小鼠腦缺血模型檢測(cè)紅薯葉總黃酮對(duì)腦的保護(hù)作用，結(jié)果提示：紅薯葉總黃酮可顯著延長(zhǎng)飽和MgCl2所致急性腦缺血小鼠和NaNO2所致小鼠中毒性缺氧的存活時(shí)間，增加斷頭小鼠喘息次數(shù)，延長(zhǎng)斷頭小鼠喘息時(shí)間，降低小鼠腦指數(shù)和MDA含量，提高T-SOD活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明紅薯葉總黃酮對(duì)模型小鼠腦缺血后的功能具有一定的維持作用，能顯著提高模型小鼠腦組織中T-SOD的活性，降低MDA的含量，并能緩解由于腦組織在急性缺血缺氧的情況下造成的腦組織水腫。各實(shí)驗(yàn)組均以尼莫地平作為陽(yáng)性對(duì)照藥，結(jié)果表明尼莫地平能起到顯著緩解腦缺血缺氧的作用，驗(yàn)證了其治療缺血性腦血管病的藥效。兩個(gè)給藥組相比較，紅薯葉總黃酮幾乎具備與尼莫地平同樣的抗腦缺血缺氧的藥效，因此可以推測(cè)長(zhǎng)期食用紅薯葉可以達(dá)到預(yù)防腦血管疾病的目的。

總之，從實(shí)驗(yàn)可以看出紅薯葉總黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化性，可以減輕氧化應(yīng)激對(duì)腦組織造成的損傷，對(duì)腦組織具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與黃酮化合物具有直接清除氧自由基活性有關(guān)。另外，紅薯葉黃酮還是天然食品的提取物兼具無(wú)毒無(wú)副作用的優(yōu)點(diǎn)，可以作為天然抗氧化劑來(lái)使用。但紅薯葉總黃酮對(duì)腦缺血缺氧疾病的最大有效給藥劑量和具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。

參?考?文?獻(xiàn)

[1]?王曉煒，鄭俊霞，魏小龍，等.抗缺氧藥物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3（21）：187-189.

[2]?黃盛藍(lán)，張家豪，梁冰雪，等.紅薯葉應(yīng)用價(jià)值及開(kāi)發(fā)利用現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（19）：309-311，313.

[3]?李蕓達(dá)，顏?zhàn)娴埽S?濤，等.羌活不同提取物對(duì)小鼠腦缺血缺氧的保護(hù)作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（4）：296-299.

[4]?李?光，余?霜，陳慶富.正交設(shè)計(jì)在紅薯葉黃酮提取中的應(yīng)用[J].北方園藝，2012（1）：41-42.

[5]?李?紅，石貞玉，李瑞玲，等.缺血、缺氧對(duì)小鼠海馬DNA甲基化的影響[J].解剖學(xué)報(bào)，2016，47（3）：289-294.

[6]?Zalewska T，Jaworska J，Ziemka-Nalecz M.Current and experimental pharmacological approaches in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy[J].Curr Pharm Des，2015，21（11）：1433-1439.

[7]?譚安雄，朱耀斌，李小云.芒果苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)醫(yī)藥藥學(xué)雜志，2011，31（23）：1928-1930.

[8]?李?哲，李君文，襲著革，等.缺氧損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，29（2）：145-148.

[9]?Hu C，Zhang Y，Kitts D.Evaluation of antioxidant and prooxidant activities of bamboo Phyllostachys nigra var.henonis leaf extract in vitro[J].Agric Food Chem，2000，48（8）：3170-3176.

[10]?趙?蕊，李青旺，張?濤.紅薯葉黃酮對(duì)老齡糖尿病模型大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，30（10）：1395-1396.

[11]?馮彩寧.紅薯葉黃酮降血糖作用研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2009.

[12]?孫小新.不同組分紅薯葉黃酮降血糖作用的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[13]?李?霞，程江霞，鮑?磊，等.右美托咪定對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、NGF、BDNF 表達(dá)的影響[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2016，20（1）：13-15.