梁麗英 陳晶 陳朝

【摘要】?目的?觀察三七總皂苷（PNS）對(duì)肝癌細(xì)胞 BEL-7404 細(xì)胞線粒體膜電位、凋亡、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的影響，并探討其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞BEL-7404 凋亡的機(jī)制。方法?將BEL-7404細(xì)胞分為：對(duì)照組、模型組、PNS組。對(duì)照組不加藥物培養(yǎng)，模型組加阿霉素（10 μg/mL）培養(yǎng)，PNS 組用不同濃度 PNS 作用于BEL-7404 細(xì)胞。CCK-8測(cè)定細(xì)胞抑制率、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡、線粒體膜電位，ELISA法檢測(cè) Caspase-3、Caspase-9表達(dá)。結(jié)果?不同濃度的PNS均可降低BEL-7404細(xì)胞線粒體膜電位，100 μg/mL的PNS作用肝癌細(xì)胞48 h后，細(xì)胞線粒體膜電位較對(duì)照組降低 （P<0.01），隨著PNS濃度的增大，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組升高 （P<0.01）。與對(duì)照組比較，PNS 對(duì)BEL-7404細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)均有不同程度的增加。20 μg/mL的PNS作用于BEL-7404細(xì)胞48 h后，Caspase-9的表達(dá)量較對(duì)照組上升（P<0.05）;40 μg/mL的PNS作用于BEL-7404細(xì)胞48 h后Caspase-3的表達(dá)量較對(duì)照組上升（P<0.05）。結(jié)論?一定劑量的三七總皂苷能降低BEL-7404細(xì)胞線粒體膜電位，可能是活化Caspase-9后激活凋亡因子caspase-3而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】?三七總皂苷;線粒體膜電位;肝癌細(xì)胞;凋亡;Caspase-3;Caspase-9

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.7?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.06.001

三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是從五加科人參屬多年生草本植物三七中提取的主要有效成分，有活血祛瘀、活絡(luò)通脈等功效。國(guó)內(nèi)外科學(xué)家對(duì)三七的藥理作用進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)表了大量的研究報(bào)告，揭示了三七在血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)以及抗炎、抗衰老等方面的生理活性。國(guó)內(nèi)有研究指出[1～3]，中藥三七有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用，但在抗腫瘤方面的實(shí)驗(yàn)研究還沒(méi)有得到廣泛的開(kāi)展，其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑和靶點(diǎn)仍缺乏深入研究。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的細(xì)胞株BEL-7404人肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，探討不同濃度的 PNS作用于人肝癌細(xì)胞株后，通過(guò)對(duì)線粒體膜電位及Caspase-9、Caspase-3相關(guān)活化因子的影響探索其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1?實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1?藥物及材料

人肝癌細(xì)胞株BEL-7404細(xì)胞（上海細(xì)胞庫(kù)提供）;1640培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco 公司;胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司;二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自 Sigma 公司;線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、凋亡試劑盒購(gòu)自BD公司;Caspase-3、Caspase-9 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司。

1.2?儀器設(shè)備

流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼，CytoFlex）、低溫高速離心機(jī)（德國(guó)eppendorf）、生物安全柜（博訊）、CO2培養(yǎng)箱（賽默飛）、酶標(biāo)儀（賽默飛）。

1.3?實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1?細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人肝癌細(xì)胞BEL-7404貼壁生長(zhǎng)于PRMI-1640培養(yǎng)液中，其內(nèi)包含有 100 U/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素，濃度為10%胎牛血清。3～4天傳代換液一次。凍存：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%的胰酶消化制成細(xì)胞懸液，移至離心管，1000 rpm離心10 min，棄上清，加入1 mL凍存液，用吸管吹打均勻制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL。轉(zhuǎn)入到凍存管，置液氮中保存。復(fù)蘇：液氮中取出的凍存管，1分鐘內(nèi)使其溶化，將細(xì)胞懸液移入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄上清，沉淀加5 mL培養(yǎng)液，吹打、離心、棄上清。加入 10 mL 全培養(yǎng)基重懸，輕微吹打均勻，將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.2?實(shí)驗(yàn)分組

①對(duì)照組：包含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、無(wú)藥物;②細(xì)胞陽(yáng)模組：包含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、加阿霉素（10 μg/mL）;③PNS組：選擇 PNS標(biāo)準(zhǔn)品（由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一購(gòu)買(mǎi)），參閱相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇PNS的終濃度為 20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL。

1.3.3?細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞BEL-7404，待細(xì)胞貼壁率達(dá)到90%以上時(shí)，胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1000 rpm/min 離心5 min。棄去上清液，加入適量含 10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，將 1.0×104個(gè)/mL細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組加藥，每孔終體積為200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL反應(yīng)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.3.4?流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種于 6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過(guò)夜，經(jīng)藥物孵育48 h后用0.25%無(wú)EDTA的胰酶消化收集所有細(xì)胞，每樣本細(xì)胞數(shù)大于1×105個(gè)/mL，用預(yù)冷的PBS洗1次后，加 400 μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻細(xì)胞后加2.5 μL Annexin-FITC和2.5 μL PI，避光孵育20 min后立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3.5?線粒體膜電位檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過(guò)夜，經(jīng)藥物孵育48 h后用 0.25%無(wú)EDTA的胰酶消化收集所有細(xì)胞，每樣本細(xì)胞數(shù)大于 1×105個(gè)/mL，用預(yù)冷的PBS洗1次：①將JC-1染料溶于二甲基亞砜（DMSO）中，制備成濃度為1 μg/μL的JC-1工作液。②將100 μL細(xì)胞懸液（105個(gè)/mL）加入5 mL的流式測(cè)定管中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照管。③在測(cè)定管中加入1 μL JC-1工作液，陰性對(duì)照管不加，輕輕混勻。④將測(cè)定管和陰性對(duì)照管置于培養(yǎng)箱中孵育15～20 min。⑤吸取500 μL PBS緩沖液分別加入測(cè)定管和對(duì)照管中，1000 rpm/mim，離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式細(xì)胞儀激發(fā)波為488 nm，紅色熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)為580/590 nm，綠色熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)為510/527 nm，以紅/綠熒光強(qiáng)度比值代表細(xì)胞線粒體膜電位的強(qiáng)度。

1.3.6?ELISA法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9的活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于 6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過(guò)夜，經(jīng)藥物孵育48 h后用 0.25%無(wú)EDTA的胰酶消化收集所有細(xì)胞，每樣本細(xì)胞數(shù)大于1×105個(gè)/mL，用預(yù)冷的PBS洗1次，將細(xì)胞重懸于0.5 mL PBS中，-20℃凍存過(guò)夜，4℃解凍，反復(fù)三次。3000 rpm/min，10 min，離心，取上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求檢測(cè)。

1.4?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)每個(gè)濃度組設(shè)5個(gè)平行孔，其余實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行孔，使用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多組間比較使用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2?結(jié)果

2.1?細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定

單因素方差分析顯示，6組在24 h、48 h、72 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），根據(jù)抑制的程度及作用時(shí)間，選擇用藥48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用藥時(shí)間。見(jiàn)表1。

2.2?PNS對(duì)BEL-7404細(xì)胞線粒體膜電位及細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度的PNS均可降低BEL-7404細(xì)胞線粒體膜電位，100 μg/mL的PNS作用于肝癌細(xì)胞48 h后，細(xì)胞線粒體膜電位較對(duì)照組降低 （P<0.01），隨著PNS濃度的增大，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組升高 （P<0.01）。見(jiàn)表2。

2.3?PNS 對(duì)BEL-7404細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9的影響

與對(duì)照組比較，PNS 對(duì)BEL-7404細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)均有不同程度的增加。20 μg/mL的PNS作用于BEL-7404細(xì)胞48 h后，Caspase-9的表達(dá)量較對(duì)照組上升（P<0.05）;40 μg/mL的PNS作用于BEL-7404細(xì)胞48 h后Caspase-3的表達(dá)量較對(duì)照組上升（P<0.05）。見(jiàn)表3。

3?討論

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌，是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，肝癌的迅速生長(zhǎng)是癌細(xì)胞增殖旺盛與凋亡減少的結(jié)果，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡已成為篩選抗癌藥物的新方向。近年的研究顯示多種中藥可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡[2～5]，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，報(bào)道比較多的傾向于藥物通過(guò)影響肝癌細(xì)胞增殖周期和抑制與癌發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)達(dá)到防癌和抗癌的目的[6]。三七總皂苷的抗腫瘤作用研究也同樣停留在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移等方面，對(duì)其誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的途徑報(bào)道及信號(hào)傳導(dǎo)甚少，由于其機(jī)制不明，未能在臨床廣泛應(yīng)用。因此尋找三七總皂苷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑和靶點(diǎn)，不僅為肝癌的治療提供了新的方法，同時(shí)也為中藥的發(fā)展開(kāi)辟了新的途徑。

本研究將體外培養(yǎng)的BEL-7404 人肝癌細(xì)胞列為研究對(duì)象，用不同濃度的三七總皂苷作用于人肝癌細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化，探討三七總皂苷對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PNS 作用于BEL-7404細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組比較，100 μg/mL組抑制率明顯增大，線粒體膜電位降低，80 μg/mL、100 μg/mL組均可顯著誘導(dǎo)BEL-7404細(xì)胞的凋亡。線粒體凋亡途徑在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中是近年來(lái)研究的熱門(mén)，是細(xì)胞凋亡途徑的中心，線粒體膜電位凌亂是細(xì)胞凋亡時(shí)早期發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)事件之一，線粒體膜電位的喪失是細(xì)胞凋亡發(fā)生的必然途徑[7～8]。隨著研究的深入，最令人關(guān)注的是線粒體在細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中的作用，以及各種線粒體蛋白在信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。其中Caspase相關(guān)蛋白在凋亡過(guò)程中起重要作用[9]。Caspase-9是凋亡的引發(fā)劑，Caspase-3 是細(xì)胞凋亡反應(yīng)中的執(zhí)行者和關(guān)鍵酶，直接參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程[10]。 通過(guò)活化脫氧核糖核酸酶，引起細(xì)胞染色體斷裂，發(fā)生細(xì)胞凋亡。通過(guò)對(duì)Caspase-3、Caspase-9的結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組比較，PNS 作用于BEL-7404細(xì)胞48 h后，可以使BEL-7404細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3表達(dá)增加，并且隨濃度增加而增加。

總而言之，三七總皂苷可能通過(guò)降低細(xì)胞線粒體膜電位，造成線粒體漲大，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞液中，與凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）連接，并與procaspase-9聚集，導(dǎo)致Caspase-9的活化，活化的Caspase-9激活Cappase-3而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。本研究以線粒體膜電位作為新的切入點(diǎn)，通過(guò)與其相關(guān)的Caspase蛋白研究三七總皂苷的藥理作用，將有助于發(fā)現(xiàn)三七總皂苷作用的新靶點(diǎn)和進(jìn)一步闡明三七總皂苷防治肝癌的分子藥理機(jī)制，為三七總皂苷對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有助于為三七應(yīng)用于防治肝癌及預(yù)防提供理論依據(jù)，并在此基礎(chǔ)上建立相關(guān)的中藥藥效篩選的細(xì)胞和分子模型。

參?考?文?獻(xiàn)

[1]?李玉云，翟瑋瑋，楊向榮，等.三七總皂苷對(duì) K562 細(xì)胞增殖胞增殖、凋亡及周期的影響及機(jī)制 [J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（8）：1103-1109.

[2]?林?成，韋忠恒，黃瑞棋.斑蝥酸鈉治療原發(fā)性肝癌的機(jī)制及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].右江醫(yī)學(xué)，2017，45（6）：744-747.

[3]?Yang Y，Yuan P，Wei X，et al.Cultivated and wild Pleurotus ferulae ethanol extracts inhibit hepatocellular carcinoma cell growth via inducing endoplasmic reticulum stress-?and mitochondria-dependent apoptosis[J].Sci Rep，2018，8（1）：13984.

[4]?吳景華，郭佳培，曹?青，等.青蒿素通過(guò)抑制IL-17/IL-17R表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2017，44（4）：697-700.

[5]?強(qiáng)?輝，馮?敏，劉慧通，等.三七皂苷對(duì)激素性股骨頭壞死早期細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2018，39（1）：111-115.

[6]?Rodenak-Kladniew B，Castro A，Strkel P，et al.Linalool induces cell cycle arrest and apoptosis in HepG2 cells through oxidative stress generation and modulation of Ras/MAPK and Akt/mTOR pathways[J].Life Sci，2018，199：48-59.

[7]?李?響，李?鄭，程?燚，等.三七總皂甙對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞株U937的抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16（4）：657-660.

[8]?Zhang X，Chen Y，Cai G，et al.Carnosic acid induces apoptosis of hepatocellular carcinoma cells via ROS-mediated mitochondrial pathway[J].Chem Biol Interact，2017，277（N）：91-100.

[9]?Shang N，Bank T，Ding X，et al.Caspase-3 suppresses diethylnitrosamine-induced hepatocyte death，compensatory proliferation and hepatocarcinogenesis through inhibiting p38 activation[J].Cell Death Dis，2018，9（5）：558.

[10]?焦佩娟，應(yīng)小平.Caspase-3與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系的中醫(yī)藥研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)雜志，2017，36（8）：721-724.