劉滿光，路文雅，李國(guó)松

(1.河北省林業(yè)科學(xué)研究院，河北 石家莊 050061；2.河北省林木良種工程技術(shù)中心，河北 石家莊 050061；3.河北省林木種苗管理站，河北 石家莊 050091)

油松Pinustabulaeformis是我國(guó)非常重要的造林和園林綠化樹(shù)種。油松枯梢病(Sphaeropsissapinea)是油松主要病害之一，該病又稱潰瘍病，分布廣泛，危害嚴(yán)重，發(fā)病癥狀主要有葉枯、流脂、芽枯及梢枯等，可危害幼苗及大樹(shù)的嫩葉、嫩枝、嫩芽和幼果等，影響松樹(shù)的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致整株樹(shù)木枯死[1-2]。目前，油松枯梢病主要采取化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥存在污染環(huán)境、持效性差以及易產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題。

亞磷酸鹽是一種非農(nóng)藥化合物，由亞磷酸與堿反應(yīng)合成，常用作還原劑和農(nóng)藥中間體，不僅可以作為肥料被植物吸收利用，而且具有誘導(dǎo)性抗病功能[3]，它可以在病菌入侵時(shí)刺激植株產(chǎn)生植物防御素，從而預(yù)防病蟲(chóng)害，增強(qiáng)樹(shù)勢(shì)。亞磷酸鹽在植物體內(nèi)持效期長(zhǎng)[4]，因此具有持久的肥效和殺菌特性。目前，亞磷酸鹽已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于疫霉菌Phytophthora的防治[5]，對(duì)玉蜀黍赤霉Gibberellazeae、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum、灰葡萄孢Botrytiscinerea、大麗輪枝菌Verticilliumdahliae及禾谷絲核菌Rhizoctoniacerealis均有抑制效果[6]。據(jù)報(bào)道，亞磷酸鉀是多種殺菌劑及肥料的活性成分，但其對(duì)油松病害防治效果鮮有報(bào)道。

作者通過(guò)室內(nèi)采用菌絲生長(zhǎng)速率法和凹玻片法測(cè)定亞磷酸鉀對(duì)油松枯梢病原菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的抑制作用，林間施用亞磷酸鉀復(fù)配劑后測(cè)定油松樹(shù)干單位電容、松針鉀(K)、磷(P)元素含量、超氧化物歧化酶(SOD)及多酚氧化酶(PPO)活性，旨在為防治油松枯梢病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 油松枯梢病菌Sphaeropsissapinea由河北省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室分離保存?zhèn)溆茫挥退煽萆也∷舍槻勺郧鼗蕧u聯(lián)峰山公園。

供試藥劑：亞磷酸鉀(K2HPO3)、硝酸銨(NH4NO3)、硫酸鎂(MgSO4)、硝酸(HNO3)，天津希恩思生化科技有限公司；杰效利(非離子表面活性劑)，邁圖高新材料(南通)有限公司；K、P標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度均為1 000 mg/L)，信陽(yáng)時(shí)得佳實(shí)業(yè)有限公司。

儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、人工氣候箱、LCR電橋、電熱鼓風(fēng)干燥箱、微波消解儀、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀、組織破碎儀、冷凍離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 菌絲生長(zhǎng)的測(cè)定 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將亞磷酸鉀試劑配成5個(gè)濃度梯度(表1)的母液備用。采用菌絲生長(zhǎng)速率法[7]，將10 mL母液倒入滅菌熔融狀態(tài)的90 mL PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒入直徑9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻凝固。用直徑5 mm的打孔器在已培養(yǎng)3 d的油松枯梢病原菌菌落邊緣取菌餅，接種于含試劑PDA培養(yǎng)基中間，置于25 ℃恒溫箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)3，5，7 d后，十字交叉法測(cè)量菌落直徑取平均值。每處理重復(fù)3次，以加10 mL無(wú)菌水的培養(yǎng)基為對(duì)照。計(jì)算亞磷酸鉀對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

菌絲生長(zhǎng)量=菌落平均直徑-菌餅直徑

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-試劑處理菌落增長(zhǎng)直徑/對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑)×100

1.2.2 孢子萌發(fā)的測(cè)定 取適量油松枯梢病松針用無(wú)菌水沖洗干凈，0.1%的升汞表面消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3次，放置在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用接種針挑取其成熟的分生孢子器，輕輕按壓，并加入適量無(wú)菌水浸泡，使分生孢子完全釋放于無(wú)菌水中，配成濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，存于-4 ℃冰箱中備用。采用凹玻片法[8]，將孢子懸浮液及配好的5.6，11.2，22.4 g/L 3個(gè)濃度梯度的亞磷酸鉀藥液各0.02 mL，滴于蓋玻片上混勻，翻轉(zhuǎn)平放于凹玻片凹槽上，放在鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，用保鮮膜保濕，置于25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫光照培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，無(wú)菌水為對(duì)照。每隔8 h鏡檢1次，共3次。每個(gè)載玻片觀察5個(gè)視野，記錄孢子萌發(fā)數(shù)量，計(jì)算萌發(fā)率及萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100

孢子萌發(fā)抑制率(%)=(1-試劑處理孢子萌發(fā)量/對(duì)照孢子萌發(fā)量)×100

1.2.3 林間樹(shù)干單位電容測(cè)定 亞磷酸鉀20%、硝酸銨10%、硫酸鎂4%、杰效利1%以及水65%進(jìn)行復(fù)配，在河北省秦皇島市聯(lián)峰山公園內(nèi)，選擇油松枯梢病均勻的油松地塊，用自流式樹(shù)干注藥技術(shù)施藥[9]。復(fù)配藥劑注射量1.0 mL/cm(胸徑)。試驗(yàn)組記為T(mén)1，對(duì)照組為清水，記為CK。參照梁軍[10]的方法用LCR電橋測(cè)定并記錄樹(shù)干電容，時(shí)間為5月6日至10月21日，每14 d調(diào)查1次，共13次。樹(shù)干電容與樹(shù)木胸徑的比值即為單位電容(nF/cm)。

1.2.4 鉀、磷含量的測(cè)定 經(jīng)1.2.3中復(fù)配劑施藥后，采集試驗(yàn)組和對(duì)照組油松松針，去除根部毛蒂，放在80 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中5 h，涼至室溫，用料理機(jī)粉粹至粉末狀，量取0.4 g于微波消解儀的消解罐內(nèi)，加硝酸10 mL，消解后趕酸，定容至50 mL，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)定結(jié)果，試驗(yàn)時(shí)間為5月6日至10月21日，每28 d測(cè)1次，共7次。鉀分析線766.4 nm，磷分析線178.2 nm。

1.2.5 酶活性的測(cè)定 經(jīng)1.2.3中復(fù)配劑施藥后，采集試驗(yàn)組和對(duì)照組油松松針，每次稱取0.2 g，表面沖洗干凈，再用無(wú)離子水沖洗2～3次，吸水紙吸干表面水分。酶液提取參考羅廣華的方法[11]，SOD活性測(cè)定參考植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[12]的氮藍(lán)四唑(NBT)法，PPO活性測(cè)定參考張茜[13]的方法。試驗(yàn)時(shí)間5月6日至10月21日，每14 d測(cè)1次，共13次。酶活性單位μg/g。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 用Excel軟件整理錄入數(shù)據(jù)，DPS 7.05、SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞磷酸鉀對(duì)油松枯梢病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 5種濃度亞磷酸鉀對(duì)油松枯梢病菌菌絲的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，抑制率隨濃度的增加而增大，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，其中，濃度28 g/L，第3天的抑制率最大，為95.51%(表1)。毒力回歸方程表明對(duì)菌絲生長(zhǎng)的EC50隨時(shí)間的增加而增大，3天的EC50最小，為7.360 g/L(表2)。

表1 亞磷酸鉀對(duì)油松枯梢病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。

表2 亞磷酸鉀對(duì)油松枯梢病原菌菌絲生長(zhǎng)的EC50

2.2 亞磷酸鉀對(duì)油松枯梢病原菌孢子萌發(fā)的影響 各濃度亞磷酸鉀對(duì)油松枯梢病菌的孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，抑制率隨濃度的增加而增大，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中，藥劑濃度22.4 g/L，24小時(shí)的抑制率最大，為50.84%(表3)。毒力回歸方程表明孢子萌發(fā)抑制率的EC50值在24 h內(nèi)隨時(shí)間的增加而減小，24 h時(shí)EC50值最小，為19.058 g/L(表4)。

表3 亞磷酸鉀對(duì)油松枯梢病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。

表4 亞磷酸鉀對(duì)油松枯梢病原菌孢子萌發(fā)的EC50

2.3 亞磷酸鉀復(fù)配劑對(duì)油松樹(shù)體干部單位電容的影響 試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)試驗(yàn)組與對(duì)照組單位電容無(wú)顯著性差異，均隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)(圖1)。對(duì)照組單位電容7月15日達(dá)到最高值，為0.998 nF/cm；試驗(yàn)組單位電容7月29日達(dá)到最高值，為1.191 nF/cm，且自6月3日開(kāi)始試驗(yàn)組單位電容均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明亞磷酸鉀復(fù)配劑有增大樹(shù)體干部電容的作用，且持效期較長(zhǎng)。

圖1 亞磷酸鉀復(fù)配劑對(duì)油松樹(shù)體干部單位電容影響

2.4 亞磷酸鉀復(fù)配劑對(duì)油松松針K、P元素含量的影響 對(duì)照組K元素含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)先下降后上升，試驗(yàn)組則隨時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降(圖2)。對(duì)照組與試驗(yàn)組P元素含量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)先下降后上升(圖3)。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)對(duì)照組K、P元素含量均高于試驗(yàn)組，7月1日后試驗(yàn)組均高于對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組K元素的含量降低了47.47%，P元素含量降低了51.43%；試驗(yàn)組K元素含量降低了26.83%，P元素含量降低了19.35%。

圖2 亞磷酸鉀復(fù)配劑對(duì)油松松針K元素含量影響

圖3 亞磷酸鉀復(fù)配劑對(duì)油松松針P元素含量影響

2.5 亞磷酸鉀復(fù)配劑對(duì)油松SOD及PPO活性的影響 試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)試驗(yàn)組與對(duì)照組SOD活性無(wú)顯著性差異，變化趨勢(shì)基本一致，均隨時(shí)間的延長(zhǎng)先降低后升高，其中7月15日SOD活性最低，分別為387.95 μg/g和651.11 μg/g。方差分析表明，5月20日至8月26日試驗(yàn)組SOD活性顯著高于對(duì)照組，8月26日后差異不顯著(圖4)。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)試驗(yàn)組與對(duì)照組PPO活性無(wú)顯著差異，變化趨勢(shì)基本一致，隨時(shí)間的延長(zhǎng)整體均呈上升趨勢(shì)。方差分析表明，6月3日后試驗(yàn)組PPO活性顯著高于對(duì)照組，10月21日達(dá)到13.37 μg/g(圖5)。

圖4 亞磷酸鉀復(fù)配劑對(duì)油松松針SOD活性影響

圖5 亞磷酸鉀復(fù)配劑對(duì)油松松針PPO活性影響

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，亞磷酸鉀對(duì)油松枯梢病原菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，抑制效果均隨藥劑濃度的增加而增大，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率可達(dá)90%以上，對(duì)孢子萌發(fā)抑制率可達(dá)50%以上，這與亞磷酸鹽可直接作用于病原菌[14]的研究結(jié)果相似，但其抑菌機(jī)制還需進(jìn)一步研究。試驗(yàn)組樹(shù)干單位電容高于對(duì)照組，且K、P含量較對(duì)照組穩(wěn)定，說(shuō)明亞磷酸鉀復(fù)配劑能夠增大樹(shù)體干部單位電容，同時(shí)能被油松吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，為其補(bǔ)充K、P元素。試驗(yàn)組SOD及PPO活性均高于對(duì)照組，說(shuō)明亞磷酸鉀復(fù)配劑可以促進(jìn)SOD活性升高，能夠在短時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)抗性，同時(shí)能顯著提高PPO活性，且持效期較長(zhǎng)，能夠長(zhǎng)時(shí)間提高油松抗性，增強(qiáng)樹(shù)勢(shì)。

試驗(yàn)中油松松針SOD活性呈先下降后上升趨勢(shì)，可能是由于5月到7月中旬比較適合油松生長(zhǎng)，此時(shí)油松體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)，植物體內(nèi)活性氧自由基的濃度較低[15]，所以SOD活性下降；隨著氣溫逐漸下降，油松體內(nèi)的生理代謝活動(dòng)減弱，打破了活性氧的產(chǎn)生和消除的動(dòng)態(tài)平衡，使植物體內(nèi)積累了較多的自由基，此時(shí)SOD活性升高。試驗(yàn)中PPO活性整體呈上升趨勢(shì)，氣溫升高，PPO活性也上升，原因是PPO酶活性與油松的抗熱、抗旱性相關(guān)；隨著氣溫的逐漸降低，松針逐漸衰老，此時(shí)PPO活性升高是油松松針抗寒性的反應(yīng)，同時(shí)可以防御病蟲(chóng)害，增強(qiáng)抗性。

本試驗(yàn)利用亞磷酸鉀等多種化合物復(fù)配，對(duì)病害的抑制及樹(shù)勢(shì)的增強(qiáng)具有協(xié)同增效作用，且復(fù)配劑所用原料對(duì)環(huán)境無(wú)污染、無(wú)殘毒，配制工藝簡(jiǎn)便，成本較低，生產(chǎn)效率高，為開(kāi)發(fā)防治油松枯梢病、提高油松樹(shù)勢(shì)的環(huán)境友好型試劑奠定了基礎(chǔ)。