宋旺弟,劉盼盼,陳 文

(石河子大學(xué)藥學(xué)院,新疆石河子 832003)

薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)是紫蘇屬唇形花科多年生草本植物,主要種植于法國南部和中國新疆等地[1]。薰衣草在維吾爾醫(yī)中,主要用于治療胸悶氣短、感冒引發(fā)的支氣管炎,睡眠障礙,關(guān)節(jié)疼痛等疾病[2]。薰衣草中的化學(xué)成分包括精油、單寧、香豆素、類黃酮、類多酚等,其中精油約占干花的1.5%,是由約50多種芳香族化合物組成,其主要成分為乙酸芳樟酯(38.04%)、芳樟醇(29.91%)等[3-4]。因薰衣草精油中物質(zhì)化學(xué)成分的不同,作用也不盡相同,有的安神助睡;有的清醒神志;有的滋潤皮膚;有的卻很粗糙;個別的還有毒性[5],因而純化和分析是十分必要的。

頂空固相微萃取(Headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)是一種新型無溶劑樣品處理技術(shù),他通過采用裝在注射器內(nèi)的石英纖維表面上的特殊固相涂層,對揮發(fā)性樣品組分進行萃取和富集,具有操作簡單、成本低、效率高及選擇性強等優(yōu)點[6]。從萃取到進樣分析,完全不需要有機溶劑,解吸快速、安全,而且可以更方便的與色譜分析儀聯(lián)用,真正做到了集萃取、濃縮和進樣為一體[7-8],大大提高了分析速度和方法的靈敏度,廣泛的應(yīng)用于揮發(fā)性成分的鑒定[9]。

分子蒸餾又稱短程蒸餾,是近年來發(fā)展起來的一種高新科技,它具有蒸餾溫度低、受熱時間短、分離程度高等優(yōu)點[10]。分子蒸餾的原理是根據(jù)分子運動理論,液體混合物受熱后分子運動加劇。當(dāng)接受到足夠的能量時,就會從液面逸出成為氣體分子。隨著液面上方氣體分子的增加,有一部分氣體分子就會返回液體,從而分離開輕組分和重組分[11]。分子蒸餾在分離物料的過程中,處于高真空和相對低溫的環(huán)境中,且停留時間極短,分離過程對物料的損傷極少,所以分子蒸餾技術(shù)特別適合對熱敏性物料進行有效無損分離[12-13]?，F(xiàn)今的分子蒸餾主要有兩種結(jié)構(gòu)形式:離心式和刮膜式[11],與離心式相比,刮膜式分子蒸餾克服了液膜分布不均勻、較高的溫度梯度等缺點,而且容易控制、運行成本較低,是目前應(yīng)用最為廣泛的一類分子蒸餾設(shè)備[14]。

本實驗以薰衣草精油為研究對象,應(yīng)用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化頂空固相微萃取的萃取條件,通過分子蒸餾法純化薰衣草精油,應(yīng)用HS-SPME-GC進行精油中主要成分的萃取和分析鑒定,為薰衣草精油中各成分的有效利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薰衣草精油 粗提物,購于伊犁潤德農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司;無水乙醇 純度>99.7%,天津市富起化工有限公司;環(huán)己酮 純度>99.5%,天津市富宇精細化工有限公司;乙酸芳樟酯 批號:DC10016230,純度>99%,上海原葉生物科技有限公司;芳樟醇 批號:B20387,純度>98%,上海原葉生物科技有限公司

VKL 70-5-WRS-T型分子蒸餾 德國瑞達有限公司;Agilent 6890N氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;100 μm PDMS萃取頭、65 μm PDMS/DVB萃取頭、75 μm CAR/PDMS萃取頭、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、手動SPME進樣手柄、15 mL帶硅橡膠墊的樣品瓶 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取萃取工藝的優(yōu)化

1.2.1.1 萃取頭老化 將首次使用的100 μm PDMS萃取頭、65 μm PDMS/DVB萃取頭、75 μm CAR/PDMS萃取頭、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在氣相色譜的進樣口老化至無雜峰,老化溫度分別為250、250、300、270 ℃,老化時間分別為0.5、0.5、1、1 h。以后每次使用前均在此溫度下老化30 min。

1.2.1.2 萃取方法 用移液槍移取2 mL的薰衣草精油于15 mL的頂空瓶中,在70 ℃的熱水浴中平衡10 min,將老化好的萃取頭插入頂空瓶,推出萃取頭距樣品約1 cm處,在70 ℃的溫度下頂空吸附40 min,收進萃取頭后,拔出針頭,迅速插入氣相色譜進樣口,每次插入襯管的長度保持一致,250 ℃下解吸5 min。

1.2.1.3 GC檢測條件 采用氣相色譜法,HP-5毛細管柱(30.0 m×320 μm×0.25 μm),FID檢測器,柱溫為110 ℃,保持20 min;進樣口溫度為250 ℃,檢測器溫度為280 ℃,分流比5∶1,載氣為N2,流速為1 mL·min-1。

1.2.1.4 單因素實驗設(shè)計 在萃取時間為40 min,平衡時間為10 min,解吸時間為5 min,萃取溫度分別為70 ℃,萃取頭分別為100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS的條件下進行萃取,通過比較GC中薰衣草精油的總峰面積來確定最佳的萃取頭。

在萃取時間為40 min,平衡時間為10 min,解吸時間為5 min,萃取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃的條件下萃取,通過比較GC中薰衣草精油的總峰面積來確定最佳的萃取溫度。

在萃取溫度為70 ℃,平衡時間為10 min,解吸時間為5 min,萃取時間分別為10、20、30、40、50 min的條件下萃取,通過比較GC中薰衣草精油的總峰面積來確定最佳的萃取時間。

在萃取溫度為70 ℃,萃取時間為40 min,解吸時間為5 min,平衡時間為1、5、10、20、30 min的條件下萃取,通過比較GC中薰衣草精油的總峰面積來確定最佳的平衡時間。

在萃取溫度為70 ℃,萃取時間為40 min,平衡時間為10 min,解吸時間分別為1、2、5、10、15 min的條件下萃取,通過比較GC中薰衣草精油的總峰面積來確定最佳的解吸時間。

1.2.1.5 星點實驗設(shè)計 以GC中薰衣草精油的總面積為考察指標(biāo),在單因素實驗的結(jié)果上,以萃取溫度(A)、萃取時間(B)、平衡時間(C)解吸時間(D)為考察因素進行星點實驗。星點設(shè)計因素水平見表1。

表1 實驗因素水平Table 1 Experimental factors and level

1.2.2 薰衣草精油純化工藝的優(yōu)化

1.2.2.1 實驗方法 用量筒量取30 mL的薰衣草精油原料,加入進料器中,開啟加熱裝置和冷卻循環(huán)系統(tǒng),根據(jù)實驗設(shè)計方案,設(shè)定好蒸餾溫度和冷卻溫度(5 ℃),溫度達到設(shè)定值后,向冷阱中加入液氮,以保護真空系統(tǒng),開啟真空泵,設(shè)定蒸餾壓力,待壓力穩(wěn)定后,調(diào)節(jié)原料滴速(2滴/3 s),開啟刮膜器,設(shè)定刮膜轉(zhuǎn)速,開始分子蒸餾過程。分餾完成后,用移液槍移取2 mL餾分,置于頂空瓶中,在萃取溫度為70 ℃,萃取時間為40 min,平衡時間為10 min,解吸時間為5 min的條件下進行萃取。

1.2.2.2 單因素考察 準(zhǔn)確量取30 mL薰衣草精油,在蒸餾壓力為0.5 kPa,刮膜轉(zhuǎn)速為320 r·min-1,蒸餾溫度為45、50、55、60、65 ℃時進行純化,以薰衣草精油中主要成分乙酸芳樟酯、芳樟醇和乙酸薰衣草酯的百分含量為考察指標(biāo),研究蒸餾溫度對薰衣草精油純化工藝的影響。

準(zhǔn)確量取30 mL薰衣草精油,在蒸餾溫度為55 ℃,刮膜轉(zhuǎn)速為320 r·min-1,蒸餾壓力為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 kPa時進行純化,以薰衣草精油中主要成分乙酸芳樟酯、芳樟醇和乙酸薰衣草酯的百分含量為考察指標(biāo),研究蒸餾壓力對薰衣草精油純化工藝的影響。

準(zhǔn)確量取30 mL薰衣草精油,在蒸餾溫度為55 ℃,蒸餾壓力為0.5 kPa,刮膜轉(zhuǎn)速為280、300、320、340、360 r min-1時進行純化,以薰衣草精油中主要成分乙酸芳樟酯、芳樟醇和乙酸薰衣草酯的百分含量為考察指標(biāo),研究刮膜轉(zhuǎn)速對薰衣草精油純化工藝的影響。

1.2.2.3 正交實驗設(shè)計 通過單因素實驗,選取主要影響純化工藝的蒸餾溫度(A)、蒸餾壓力(B)、刮膜轉(zhuǎn)速(C)為考察因素,以乙酸芳樟酯、芳樟醇、乙酸薰衣草酯的百分含量為考察指標(biāo),采用L9(34)正交表進行實驗。因素水平表見表2。

表2 因素水平Table 2 Factor and levels

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用軟件SPSS 16.0、Origin8和Design-Expert V8.0.6對頂空固相微萃取的萃取條件進行單因素實驗結(jié)果分析處理,單因素實驗均重復(fù)3次。用軟件SPSS 16.0對分子蒸餾的蒸餾條件進行設(shè)計并處理相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空固相微萃取萃取工藝的優(yōu)化

2.1.1 單因素考察

2.1.1.1 萃取頭對總峰面積的影響 在固相微萃取中,通常應(yīng)結(jié)合待測化合物的極性、沸點和分配系數(shù),選用最合適涂層材料的萃取纖維對樣品進行萃取。但適合于薰衣草精油揮發(fā)物萃取的萃取纖維目前還沒有報道,因此,本實驗分析比較了四種不同類型的固相微萃取纖維膜對薰衣草精油揮發(fā)性物質(zhì)萃取效率的影響。由圖1可以看出,50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對薰衣草精油的萃取效果最佳,因此選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭萃取薰衣草精油。

圖1 萃取頭類型對總峰面積的影響Fig.1 Effects of fiber type on the peak area

2.1.1.2 萃取溫度對總峰面積的影響 在固相微萃取中,溫度是影響萃取的最重要因素。萃取溫度對HS-SPME的影響具有雙重效應(yīng),溫度過高,可加快分子熱運動,縮短平衡時間,但分析物在涂層與基質(zhì)中的分配系數(shù)會降低,涂層對分析物的吸附量減小,從而影響HS-SPME的靈敏度。由圖2可以看出,隨著溫度的升高,吸附量逐漸上升,當(dāng)萃取溫度為70 ℃時,所檢測的總峰面積最大,隨著溫度的繼續(xù)上升,吸附量呈逐漸下降的趨勢。萃取溫度為50 ℃時,測得的總峰面積最小,由于溫度較低時不利于低揮發(fā)性化合物的揮發(fā)。而溫度過高時,萃取頭的吸附效果變差,這可能是由于溫度升高,揮發(fā)性物質(zhì)不穩(wěn)定,發(fā)生化學(xué)反應(yīng),導(dǎo)致分析結(jié)果失真。考慮上述因素,選用70 ℃作為中心點。

圖2 萃取溫度對總峰面積的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the peak area

2.1.1.3 萃取時間對總峰面積的影響 影響萃取時間的因素主要包括萃取頭的選擇、分配系數(shù)、樣品的擴散系數(shù)、頂空體積、樣品萃取的溫度等,萃取剛開始時,萃取頭吸附比較快,接近平衡時速度就極其緩慢,但在平衡之前萃取頭中的物質(zhì)量與其濃度就已存在一個比例關(guān)系,所以在接近平衡時就可以完成萃取過程。由圖3可以看出,隨著時間的延長,吸附量逐漸上升,當(dāng)萃取時間為40 min時,總峰面積達到最大,隨著時間的延長,總峰面積有所下降?？赡苁怯捎谳腿r間延長會導(dǎo)致萃取頭固有組分的流失,導(dǎo)致萃取能力降低,吸附量減小。考慮上述因素,選用40 min作為中心點。

圖3 萃取時間對總峰面積的影響Fig.3 Effects of extraction time on the peak area

2.1.1.4 平衡時間對總峰面積的影響 由圖4可以看出,隨著平衡時間的延長,吸附量逐漸上升,當(dāng)平衡時間為10 min時,測得的總峰面積達到最大,隨著時間的繼續(xù)延長,吸附量呈下降的趨勢,可能是因為溫度較高,樣品易揮發(fā),時間越長,揮發(fā)越多,所以曲線呈下降趨勢。當(dāng)平衡時間為1 min時,測得的總峰面積最小,可能是由于平衡時間太短,許多低揮發(fā)性物質(zhì)沒有揮發(fā),導(dǎo)致吸附量較低。考慮上述因素,選用10 min作為中心點。

圖4 平衡時間對總峰面積的影響Fig.4 Effects of equilibrium time on the peak area

2.1.1.5 解吸時間對總峰面積的影響 有圖5可以看出,隨著平衡時間的延長,吸附量逐漸上升,當(dāng)解吸時間為5 min時,測得的總峰面積達到最大,隨著時間的繼續(xù)延長,吸附量呈先減小后升高的趨勢,可能是由于萃取頭涂層中吸附的揮發(fā)性物質(zhì)幾乎已被解吸出去,時間越長,其中的雜質(zhì)也隨之揮發(fā),從而使主成分的含量降低?？紤]上述因素,選用5 min作為中心點。

圖5 解吸時間對總峰面積的影響Fig.5 Effects of parse time on the peak area

2.1.2 星點實驗結(jié)果 在單因素實驗基礎(chǔ)上,設(shè)定萃取溫度、萃取時間、平衡時間、解吸時間為自變量,以薰衣草精油的總峰面積為考察指標(biāo),采用星點設(shè)計效應(yīng)面優(yōu)化頂空固相微萃取的萃取條件,實驗安排及結(jié)果見表3。

表3 星點實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Results of central composite design

2.1.3 響應(yīng)面分析 對表3中數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合,得回歸方程:Y(×103)=7.05+0.05A+0.1B-0.17C+0.05D-0.11AB+0.15AC-0.048AD-0.12BC-0.11BD+0.23CD-0.55A2-0.49B2-0.36C2-0.29D2,r=0.9209。

利用Design-Expert.V8.0.6軟件對上述擬合方程進行系數(shù)顯著性檢驗和方差分析,結(jié)果如表4所示。

由表4可知,方程的二次項CD的p值為0.0134,對實驗結(jié)果影響顯著,A2、B2、C2、D2的p值小于0.0001,對實驗結(jié)果影響極其顯著,B、C的p值分別為0.0454和0.0032,對實驗結(jié)果影響顯著。表4可知,失擬項F值為0.2128,大于0.05,影響不顯著,說明模型中無失擬因素存在,方程決定系數(shù)R2為0.9209,說明響應(yīng)值的變化有92.09%來源于所選變量。

表4 回歸模擬方差分析Table 4 Analysis of variance for regression model

根據(jù)Design Expert V8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行系統(tǒng)分析,得到頂空固相微萃取的最佳萃取工藝參數(shù):萃取溫度69.96 ℃、萃取時間41.44 min、平衡時間10.47 min、解吸時間5.81 min。預(yù)測在此工藝下萃取頭萃取薰衣草精油所得的總峰面積為7780.3。根據(jù)實際條件對工藝參數(shù)進行修正,得到頂空固相微萃取的最終萃取工藝條件為:萃取溫度70 ℃、萃取時間41 min、平衡時間10 min、解吸時間6 min。

2.1.4 最佳工藝驗證實驗 取2 mL的薰衣草精油,按優(yōu)選的工藝條件進行萃取,重復(fù)3次,結(jié)果總峰面積分別為7795、7747、7708,實際值與預(yù)測值的相對誤差為0.28%,表明優(yōu)選的萃取工藝穩(wěn)定可行。

2.2 薰衣草精油純化工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素對薰衣草精油純化工藝的影響

2.2.1.1 蒸餾溫度對薰衣草精油純化工藝的影響 在蒸餾壓力為0.5 kPa,刮膜轉(zhuǎn)速為320 r·min-1時,由圖6可知,乙酸芳樟酯和乙酸薰衣草酯的純度隨著蒸餾溫度的升高而降低,而芳樟醇的純度反而升高,這是因為沸點較低的芳樟醇隨著溫度的升高,大量的進入輕組分中,從而使乙酸芳樟酯和乙酸薰衣草酯的含量相對的降低,為了讓輕組分和重組分更好的分離,選用55 ℃作為中心點。

圖6 蒸餾溫度對三種主要組分純度的影響Fig.6 Effects of distillation temperature on the purity of three main components

2.2.1.2 蒸餾壓力對薰衣草精油純化工藝的影響 在蒸餾溫度為55 ℃,刮膜轉(zhuǎn)速為320 r·min-1時,由圖7可知,三種成分隨著蒸餾壓力的升高,其純度變化不大,趨于平緩,芳樟酯、乙酸芳樟酯和乙酸薰衣草酯的純度分別在蒸餾壓力為0.4、0.5和0.6 kPa時，達到最大值。選用0.5 kPa作為中心點。

圖7 蒸餾壓力對三種主要組分純度的影響Fig.7 Effects of distillation pressure on the purity of three main components

2.2.1.3 刮膜轉(zhuǎn)速對薰衣草精油純化工藝的影響 刮膜轉(zhuǎn)速是分子蒸餾過程中的另一重要參數(shù),在蒸餾溫度為55 ℃,蒸餾壓力為0.5 kPa時,由圖8可知,乙酸芳樟酯隨著刮膜轉(zhuǎn)速的升高,純度呈升高趨勢,但刮膜轉(zhuǎn)速高于320 r min-1時,其純度又呈下降趨勢;而芳樟醇和乙酸薰衣草酯的純度隨著刮膜轉(zhuǎn)速的升高呈升高趨勢,總體都較平緩。所以選用320 r·min-1作為中心點。

圖8 刮膜轉(zhuǎn)速對三種組分純度的影響Fig.8 Effects of wiper speed on the purity of three main components

2.2.2 正交實驗結(jié)果 薰衣草精油純化工藝的正交實驗結(jié)果見表5。

表5 L9(34)正交實驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 5 L9(34)orthogonal experiment design and result analysis

直觀分析結(jié)果:采用矩陣分析法,計算可得各個因素對正交實驗的指標(biāo)值影響的主次順序依次是A>C>B,最優(yōu)條件為A2B3C3,但從單因素實驗可以看出,當(dāng)刮膜轉(zhuǎn)速升高時,對這三種成分的純度影響并不大,而刮膜轉(zhuǎn)速越大,揮發(fā)油在膜上停留的時間越長,不利于實際生產(chǎn),所以選用C2。因此,正交實驗的最優(yōu)方案為A2B3C2,即蒸餾溫度為55 ℃,蒸餾壓力為0.6 kPa,刮膜轉(zhuǎn)速為320 r·min-1。

2.2.3 驗證實驗 按照上述最優(yōu)條件,重復(fù)3次,測得薰衣草精油中三種主要組分的純度分別為45.11%、25.52%、14.27%,RSD分別為0.33%、0.46%、0.29%,說明該方法穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

本文通過單因素實驗,對頂空固相微萃取的萃取頭類型、萃取溫度、平衡時間、萃取時間、解吸時間進行了考察,并采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法對萃取條件進行了優(yōu)化,得到萃取的最佳條件是纖維萃取頭類型50/30 μm DVB/CAR/PDMS、萃取溫度70 ℃、萃取時間41 min、平衡時間10 min、解吸時間6 min。

本實驗根據(jù)單因素考察,采用正交設(shè)計優(yōu)化分子蒸餾的蒸餾條件,得到最佳的蒸餾條件是蒸餾溫度55 ℃,蒸餾壓力0.6 kPa,刮膜轉(zhuǎn)速320 r·min-1,在此條件下,薰衣草精油中各成分富集的結(jié)果為乙酸芳樟酯由26.37%提高到45.11%、芳樟醇由8.97%提高到25.52%、乙酸薰衣草酯由3.02%提高到14.27%,因此,分子蒸餾技術(shù)適用于薰衣草精油中揮發(fā)性成分的高效富集。

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