婁文娟,歐陽凡,董文賓

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安 710021)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生草本植物,大多分布在云貴、江浙一帶?，F(xiàn)有化學分析鐵皮石斛復(fù)含多糖、生物堿及少量黃酮和酚類物質(zhì)[1],大量藥理學研究表明鐵皮石斛具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等諸多功效[2-3],極具藥用價值和保健特性。其中石斛多糖為鐵皮石斛藥用有效性和保健功能的主要體現(xiàn)物質(zhì)[4-6]。

鐵皮石斛自然條件下不易生長,且難以控制品質(zhì)質(zhì)量[7],現(xiàn)廣泛運用的植物組織培養(yǎng)技術(shù)[1]確保了穩(wěn)定且充足的鐵皮石斛來源。在此基礎(chǔ)上,鐵皮石斛組培體系的質(zhì)量標準急需確定并統(tǒng)一,因此組培過程中多糖積累的研究是獲得穩(wěn)定且高質(zhì)的種苗的前提,由此盡可能獲得多糖含量高的原料來源,實現(xiàn)功能保健性與經(jīng)濟利益的最大化。

目前鐵皮石斛多糖積累的研究多局限在單一因素如激素[8]、基本培養(yǎng)基[9]、溫濕度[10]等,對多因素的綜合作用研究較淺。故本實驗基于具有強生命活性的原球莖為載體,以多糖含量為篩選指標,研究了多種不同因素對鐵皮石斛的多糖積累的影響,從而獲得優(yōu)化后多糖含量高的組培苗,以便進行后期進一步生產(chǎn)與加工。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛種子 陜西秦脈蘭業(yè)有限公司;硝酸鉀 深圳南山有限公司，分析純;硝酸銨 西安化學試劑廠，分析純;蔗糖 天津盛奧化學試劑有限公司，分析純;芐基腺嘌呤(BA) 上海藍季科技發(fā)展有限公司，化學純;激動素(KT) 上海山浦化工有限公司,化學純;無水葡萄糖 天津市科密歐有限公司,分析純;香蕉汁、椰汁 均為市售自配。

SC-3610型低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;DZ-1BC型真空干燥箱 上海艾測電子科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 西安安泰儀器科技有限公司;UV-2600型紫外可見光分光光度計 上海儀分科學儀器有限公司;電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;高壓滅菌鍋 杭州亞旭生物科技有限公司;250B型光照培養(yǎng)箱 金壇市城東新瑞儀器廠;SW-CJ-1型單人凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原球莖的獲得 選取長勢均一良好的鐵皮石斛種子,在超凈工作臺上用氯化汞處理1 min和無水乙醇沖洗5～8次后,接種至MS+NAA 0.4 mg/L+BA 1.8 mg/L+椰汁100 g/L固體培養(yǎng)基放在光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)溫度為(20±2) ℃，濕度為60%，pH為5.5，保證光照10 h/d,光照強度(3000±20) lx,增殖繼代3次,每20 d繼代1次,選出長勢均勻翠綠茁壯的原球莖。

1.2.2 原球莖的轉(zhuǎn)接培養(yǎng) 選取長勢均勻翠綠的原球莖,按照下述實驗設(shè)計接種到不同配方的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),培養(yǎng)條件與1.2.1保持一定,培養(yǎng)50 d后對原球莖進行多糖含量的測定。

1.2.3 多糖的測定 采用苯酚-硫酸法[11-12]。

1.2.4 Plackett-Burman設(shè)計 基于Minitab軟件進行Plackett-Burman實驗設(shè)計,所選的每個因素取高低兩個水平,高水平一般為低水平的1.5～2.5倍。通過前期實驗工作,本實驗選出影響較大的7個因素,即氮源分子比、蔗糖、BA、KT、接種量、香蕉汁、椰汁。其他因素如NAA、溫度、pH、光照時間和強度保持恒定,選用N=12的Plackett-Burman 設(shè)計表,另設(shè)3個虛擬變量,用于考察實驗誤差。各因素所代表參數(shù)、水平見表1。根據(jù)所得結(jié)果分析各因素對多糖含量Y水平的效應(yīng),并進行顯著性(p<0.05)評價,從而獲得對Y水平有顯著影響的因素,篩選后的不顯著因素在本實驗不再考慮進行深入研究,之后進行的實驗皆取最低水平。

表1 Plackett-Burman 實驗因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

注:硝態(tài)氮和銨態(tài)氮分子比是在氮濃度為60 mmol/L的情況下分子比的比值。

1.2.5 最陡爬坡實驗設(shè)計 在得到顯著因素后,使因素水平同時朝向響應(yīng)值的最大方向變化,逼近最大響應(yīng)區(qū)間找出峰值,才能建立有效響應(yīng)面方程[13]。在本實驗中,對多糖含量影響不明顯的因素都選取最低水平,將得到的3個顯著因素(硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比、蔗糖、BA)根據(jù)響應(yīng)值最大化的方向為爬坡方向,再依據(jù)3個顯著因素各因素效應(yīng)值與比例來確定變化步長,以便更快鎖定最佳值區(qū)域。

1.2.6 Box-Behnken實驗設(shè)計 根據(jù) Box-Behnken的中心復(fù)合實驗設(shè)計原理,結(jié)合之前得到的實驗結(jié)果,基于Desgin-Expert軟件進行Box-Behnken 實驗設(shè)計。以多糖含量為考察指標,選取硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比(A)、蔗糖(B)、BA(C)3個對顆粒質(zhì)量影響較顯著的因素為自變量,每個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼。每組重復(fù)三次,實驗結(jié)果取均值,實驗因素水平設(shè)計試驗見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平Table 2 Factors and levels in RSA

注:硝態(tài)氮和銨態(tài)氮分子比是在氮濃度為60 mmol/L的情況下分子比的比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)方差分析和顯著性研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗篩選主效應(yīng)因子

以鐵皮石斛原球莖為實驗材料,以多糖含量為響應(yīng)值,對影響多糖含量的7個因素(硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比、蔗糖、BA、KT、接種量、香蕉汁、椰汁)進行綜合全面的篩選,并于3個空項(D、G、J)作誤差分析,實驗結(jié)果見表3,7個因素對考察指標影響的次序見圖1和表4。

圖1 影響因素標準化的帕拉圖Fig.1 Pareto chart of influencing factor standardization

由圖1和表4可知,因素B(蔗糖)、E(BA)、F(硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比)效應(yīng)顯著,p值分別為0.031、0.045、0.048,可作為Box-Behnken進一步優(yōu)化研究實驗的因素。其他因素效應(yīng)不顯著,對響應(yīng)值影響不大,出于顯著性影響和經(jīng)濟成本的考慮,凡是影響不顯著因素取低水平保持一致即可。

表3 Plackett-Burman 實驗設(shè)計及結(jié)果(n=3)Table 3 Design and results of Plackett-Burman tests(n=3)

表4 回歸系數(shù)顯著性分析Table 4 Significance analysis of regression coefficient

注:p<0.01為極顯著**,p<0.05為顯著*。

2.2 最陡爬坡實驗結(jié)果分析

對Plackett-Burman實驗結(jié)果進行分析,可以看出因素B(蔗糖)、E(BA)、F(硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比)對于原球莖多糖含量均有積極的促進作用。適當?shù)卦黾右蛩谺(蔗糖濃度)、E(BA濃度)、F(硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比)的量,會使多糖含量升高。蔗糖為原球莖提供了能量來源和大分子物質(zhì)[14]的合成材料,加速其新陳代謝,有效促進了石斛多糖的合成。而氮源的比例使原球莖朝著增殖或分化的方向發(fā)展[15],多糖的積累大多在分化階段。當培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮多過銨態(tài)氮,表現(xiàn)為石斛多糖含量的增加時,則說明硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比越高會促進原球莖分化,從而積累更多的活性成分。細胞分裂素BA的加入可有效促進原球莖的生長活性[16],一定程度上會促進多糖的積累。

按照之前PB法得出的三個顯著影響因素效應(yīng)的大小確定最陡爬坡實驗的爬坡方向和步長,盡可能來逼近最大響應(yīng)值(多糖含量)的區(qū)域,實驗設(shè)計與結(jié)果見表5。

由表5可以看出,在第4組實驗中多糖含量最高,表明第4組實驗的周圍存在著最優(yōu)點。則用實驗4的條件為響應(yīng)面實驗因素水平的中心點,即蔗糖濃度、BA濃度、硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比分別為30 g/L、1.6 mg/L、2∶1。

表5 最陡爬坡實驗設(shè)計和結(jié)果Table 5 Design matrix and experimental results of steepest accent

2.3 Box-Behnken實驗結(jié)果分析

對三個因素硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比(A)、蔗糖濃度(B)、BA濃度(C)進行中心組合設(shè)計,并利用Design-Expert軟件對15個實驗點進行分析,如表6顯示為實驗設(shè)計及結(jié)果。實驗9、14、15為區(qū)域的中心點,另外12個點為析因點。

表7 Box-Behnken實驗方差分析結(jié)果Table 7 Analysis of variance of Box-Behnken experiment

注:p≤0.0001為高度顯著,用**表示;p≤0.05為顯著,用*表示;p>0.05為不顯著。

表6 RSM實驗設(shè)計和結(jié)果Table 6 Experimental design of RSM and corresponding results

實驗結(jié)果經(jīng)方差分析后所得模型的二次多項回歸方程:Y=33.85-0.27A-1.12B+0.79C+1.34AB-1.17AC-0.70BC-4.29A2-4.04B2-2.20C2。

在本實驗所選定的因素水平范圍內(nèi),各因素對原球莖多糖含量的影響順序為:蔗糖>BA>硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比。根據(jù)回歸方程作出的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖2～圖4。圖中能夠較為清楚地表現(xiàn)出各因素及其兩兩之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。根據(jù)等高線的形狀可以判斷兩因素間的交互效應(yīng)對響應(yīng)值的影響,圓形表現(xiàn)為不顯著,而橢圓形體現(xiàn)著顯著。

圖2 氮源分子比和蔗糖對多糖含量交互影響的 響應(yīng)面面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for effect of interaction between nitrate/ammonium molecule ratio and sucrose

圖2顯示了當BA濃度一定時,多糖含量隨著氮源分子比和蔗糖添加量的增加而增加,且蔗糖添加量比氮源分子比對多糖含量影響更為明顯,從等高線圖可判斷出這兩個因素間存在明顯的交互作用。如圖3所示,當蔗糖添加量一定時,一定范圍內(nèi)多糖含量隨著硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比和BA濃度的增加而增加,且BA濃度相對于氮源分子比對多糖含量更顯著,這兩個因素之間存在著明顯的交互作用。觀察圖4響應(yīng)面圖的響應(yīng)趨勢可知,多糖含量隨著蔗糖和BA濃度的加大而增加,但到達中心區(qū)域后,多糖含量下降,并且蔗糖濃度相對BA濃度對多糖含量影響更為顯著。由等高線圖和方差分析表可知蔗糖添加量和BA濃度兩個因素之間不存在交互作用。

圖3 氮源分子比和BA對多糖含量交互影響的 響應(yīng)面面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for effect of interaction between nitrate/ammonium molecule ratio and BA concentration

圖4 蔗糖和BA對多糖含量交互影響的 響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for effect of interaction between sucrose and BA concentration

2.4 最佳培養(yǎng)條件的驗證

通過Design-Expert軟件根據(jù)二次多項回歸方程求一階偏導(dǎo)得出Y的極大值是在A=-0.09,B=-0.87,C=0.05,即硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比、蔗糖、BA分別為1.91∶1,29.13 g/L,1.65 mg/L時原球莖的多糖含量最大為34.05%,相對于優(yōu)化前實驗(MS+BA 2.0 mg/L)得到的多糖含量25.36%已有顯著提升?？紤]到實際操作和實驗設(shè)計的可行性,將上述最佳條件修正為硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比為1.90∶1,蔗糖添加量為29.1 g/L,BA濃度為1.65 mg/L。在此條件下重復(fù)驗證實驗5次,測得培養(yǎng)的原球莖多糖平均含量為33.95%,與理論預(yù)測值34.05%的相對誤差較小,這說明實驗中的回歸方程適合于原球莖多糖含量的預(yù)測和分析。

3 結(jié)論

本實驗在鐵皮石斛快繁體系中選擇生長旺盛的原球莖階段作為多糖積累的載體,運用Plackett-Burman設(shè)計從7種影響原球莖多糖含量的培養(yǎng)基成分中確定了硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比、蔗糖和BA濃度為影響多糖含量最顯著的影響因素。本著最快找出中心點的目的,設(shè)計了最陡爬坡實驗并進一步進行Box-Behnken Design響應(yīng)面方法分析,得出回歸模型存在的最優(yōu)結(jié)果為:當硝態(tài)氮/銨態(tài)氮分子比、蔗糖濃度、BA濃度分別為1.90∶1,29.1 g/L,1.65 mg/L時,多糖含量由優(yōu)化前的25.36%提高到了33.95%,優(yōu)化效果明顯,在保證快速繁育的同時得到了較高質(zhì)量的鐵皮石斛苗。

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