周珠法

(浙江農(nóng)業(yè)商貿(mào)職業(yè)學院烹飪旅游系,浙江紹興 312000)

牛肉富含人體必需的氨基酸和部分微量元素,是我國主要肉類食品之一。相比于豬肉而言,牛肉的蛋白質(zhì)含量高,脂肪和膽固醇含量較低,營養(yǎng)價值豐富,深受廣大消費者的喜愛[1]。隨著我國居民消費水平的提高,牛肉在肉類消費總量中的比重逐年增加,同時消費者對牛肉品質(zhì)也提出更高要求。嫩度是決定牛肉品質(zhì)最重要的因素,也是消費者購買意愿的重要指標[2],所以嫩度的高低在一定程度上決定著牛肉的品質(zhì)和價格,因此,如何提高牛肉嫩度成為改善牛肉品質(zhì)的基礎(chǔ)。

近年來,許多學者一直致力于改善肉類嫩度的研究,并提出多種嫩化方法,如低溫吊掛、機械滾揉、電刺激、超聲波、鈣鹽注射、磷酸鹽處理、高壓處理、外源酶處理等[3-4]。在眾多方法中,外源酶嫩化法因具有操作簡單、不需要額外增加設(shè)備、基本不改變生產(chǎn)工藝、顯著提高牛肉嫩度等優(yōu)點,而受到肉類研究者的重視[5-7]。木瓜蛋白酶是最常用的肉類嫩化外源酶,其酶活高、性質(zhì)穩(wěn)定、蛋白水解能力強、綠色安全,不僅可以提高肉的嫩度,改善肉的風味,而且不產(chǎn)生不良風味,因此廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)[8-9]。趙立等[10]以剪切力為評價指標,對木瓜蛋白酶嫩化鴨肉的工藝進行優(yōu)化。肖夏等[11]以剪切力為評價指標,輔以質(zhì)構(gòu)特性,考察了復合酶(木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶)嫩化牛肉工藝,處理后牛肉剪切力顯著下降,質(zhì)構(gòu)特性較好保持。林志民等[12]以感官評價為評價指標,考察木瓜蛋白酶對牛肉嫩化的影響,發(fā)現(xiàn)酶濃度過大時會導致牛肉的過度嫩化,降低感官評價。李麗杰等[13]以剪切力為評價指標,輔以質(zhì)構(gòu)特性,研究木瓜蛋白酶法嫩化鹿肉工藝,嫩化后鹿肉剪切力值顯著降低(p<0.01),咀嚼力值與剪切力值存在正相關(guān)關(guān)系,彈性與剪切力不相關(guān)。夏軍軍等[14]以剪切力為評價指標,考察了木瓜蛋白酶嫩化牛腿肉工藝條件,在優(yōu)化的條件下牛腿肉的剪切力與對照組相比顯著降低。目前牛肉嫩化工藝是以剪切力作為條件篩選的唯一或主要評價指標,以確定最優(yōu)條件。然而,剪切力最低的條件下,牛肉感官評價、質(zhì)構(gòu)特性往往不是最佳的。牛肉嫩化最終目標還是為食用服務(wù),過度追求剪切力的降低,反而會影響牛肉的食用品質(zhì)。陶瑞等[15]研究發(fā)現(xiàn),木瓜蛋白酶過大導致肉塊老化,水分流失,感官評價下降,但是剪切力卻升高。因此,嫩化工藝條件的確定有必要采用剪切力和感官評價雙指標來評價優(yōu)化的效果,以確保較佳的食用品質(zhì)。

表2 牛肉的感官評定標準Table 2 Standards of sensory evaluation of beef

本研究采用響應(yīng)面優(yōu)化法,以牛肉嫩化效果廣泛采用的剪切力測定和感官評價作為評價指標[16],考察木瓜蛋白酶對牛肉嫩化的影響,并對優(yōu)化后的嫩化牛肉與對照組進行質(zhì)構(gòu)特性及系水性比較,最后進行初步嫩化機制研究,以期得到更加客觀、準確的評價結(jié)果,為改善外源蛋白酶在牛肉加工技術(shù)中的應(yīng)用提供一定的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉 外脊,市售;木瓜蛋白酶 酶活10萬U/g，西安瑞盈生物科技有限公司;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 北京康普匯維科技有限公司;氯化鎂、氯化鉀 國藥集團工業(yè)股份有限公司;乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA) 山東佰仟化工有限公司;HE染色試劑盒 北京諾博萊德科技有限公司。

TA.XT Plus物性測定儀 英國Stable Micro Systems公司;10001型電子天平 常州市宏衡電子儀器廠;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市郎博儀器制造有限公司;控溫多用高速組織搗碎機 常州恒隆儀器有限公司;CTH1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘立科學儀器有限公司;UV1901紫外可見分光光度計 上海奧析科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛肉嫩化處理 精密稱取0.6 g木瓜蛋白酶,置于1 L pH7.0的磷酸鹽緩沖液中,攪均,4 ℃保存待用。

將牛肉剔除結(jié)締組織、淋巴及脂肪,順著肌纖維紋絡(luò)切成3 cm×3 cm×10 cm的肉塊,采用均勻注射法進行嫩化處理,每塊肉注射0.06%的木瓜蛋白酶20 mL,在50 ℃條件下處理2 h。

1.2.2 單因素實驗 固定pH7.0,處理溫度50 ℃,處理時間2 h,考察不同酶濃度(0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%)對牛肉剪切力和感官評價的影響;固定酶濃度0.08%,處理溫度50 ℃,處理時間2 h,考察不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)對牛肉剪切力和感官評價的影響;固定酶濃度0.08%,pH6.5,處理時間2 h,考察不同處理溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對牛肉剪切力和感官評價的影響;固定酶濃度0.08%,pH6.5,處理溫度55 ℃,考察處理時間(0、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h)對牛肉剪切力和感官評價的影響,實驗重復3次。進行單因素實驗,考察各因素對牛肉剪切力和感官評價的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 以單因素實驗結(jié)果為依據(jù),采用Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計,對牛肉嫩化工藝進行響應(yīng)面優(yōu)化。實驗設(shè)計見表1,實驗重復3次。

表1 牛肉嫩化Box-Behnken設(shè)計因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design for beef tenderness

1.2.4 剪切力的測定 按NY/T 1180-2006[17]方法進行測定。

1.2.5 感官評價 參考GB/T 16291.1-2012[18]以及金慧玉[5]、韓東潔等[19]的評價方法。將嫩化處理后的牛肉切成1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm小塊,放入蒸煮袋中,在95 ℃水浴鍋中加熱至牛肉中心達到70 ℃,取出牛肉冷卻至室溫,牛肉品質(zhì)從色澤、氣味、口感、外觀4個方面進行評價,選擇接受過專業(yè)訓練的10名食品人士組成感官評定小組,根據(jù)牛肉感官質(zhì)量評分標準(表2)給予評分,計算平均值。

1.2.6 烹飪失水率和持水率的測定 按響應(yīng)面優(yōu)化條件對牛肉進行嫩化處理,同時以不加木瓜蛋白酶,其他條件同嫩化處理的牛肉作為對照組,按1.2.5中煮制條件進行煮制,用濾紙擦干牛肉表面水分,按照孟祥忍等[20]的方法測定失水率和持水率。

1.2.7 質(zhì)構(gòu)特性分析 按照羅亞蘭等[21]的測定方法對響應(yīng)面優(yōu)化條件嫩化處理和未加木瓜蛋白酶嫩化處理的對照組牛肉進行質(zhì)構(gòu)特性分析,測試條件:采用TPA模式,探頭型號:P/50;下行速度:4 mm/s;測試速度:5 mm/s;返回速度:5 mm/s;壓縮樣品高度為50%;時間:5 s;觸發(fā)力:5 g。測試項目有硬度、彈性、咀嚼性和內(nèi)聚力。

1.2.8 肌原纖維小片化指數(shù)(MFI值)測定 按武軍等[22]的測定方法對1.2.7中優(yōu)化處理組和對照組牛肉進行測定。

1.2.9 肌纖維密度和肌纖維直徑的測定 參考Olson D[23]及王海麗等的實驗方法[24],將1.2.7中優(yōu)化處理組和對照組牛肉,順肌纖維方向切成3 cm×2 cm×1 cm的組織塊,固定在4%甲醛溶液中,石蠟包埋,常規(guī)切片,厚度4～6 μm,然后使用木精-伊紅染液染色10 min,水洗至無色,中心樹脂封固,每個樣品制3片標本備用,用顯微觀察,并用顯微圖像分析儀測定以下項目:

肌纖維密度:在10×10倍光鏡下隨機選10個視野,統(tǒng)計視野中肌纖維根數(shù),換算得到1 mm2的纖維數(shù)目;

肌纖維直徑:在10×40倍光鏡下隨機測量100根肌纖維的直徑,其平均值即為肌纖維直徑。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,采用Orign 8.0、SPSS 19.0及Design-Expert 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 酶濃度對牛肉嫩化的影響 由圖1可以看出,隨著木瓜蛋白酶濃度的增加,牛肉的剪切力逐漸降低,而感官評價卻表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。當酶濃度為0.08%時,剪切力為27.27 N,感官評價達到最高,為74.30分;當酶濃度為0.14%時,剪切力最低,為19.31 N,感官評價為65.60分。這是因為酶濃度增加,反應(yīng)速度也加快,單位時間內(nèi)牛肉中肌原纖維的降解程度也相應(yīng)增加,剪切力就越低,但是當酶濃度過大時(超過0.08%),牛肉中蛋白會因過度降解而失去食用價值[15],感官評價也開始降低。

圖1 酶濃度對剪切力和感官評價的影響Fig.1 The influence of enzyme concentration on shear force and sensory evaluation

2.1.2 pH對牛肉嫩化的影響 由圖2可以看出,隨著pH的增加,牛肉的剪切力呈現(xiàn)先快速下降而后緩慢增加的趨勢,而感官評價呈先增后降的趨勢。當pH為6.5時,剪切力最低,為25.23 N,而感官評價最高,為78.10分。這可能是因為pH6.5為木瓜蛋白酶的最適pH,此時木瓜蛋白酶處于最佳構(gòu)象狀態(tài),有利于酶解反應(yīng)的進行[24]。

圖2 pH對剪切力和感官評價的影響Fig.2 The influence of pH on shear force and sensory evaluation

2.1.3 處理溫度對牛肉嫩化的影響 由圖3可以看出,不同溫度條件下,剪切力和感官評價呈現(xiàn)和pH類似的變化趨勢,當溫度為55 ℃時,剪切力最低,為20.78 N,而感官評價最高,為79.40分。這是因為隨著溫度升高,酶活增加,剪切力下降,感官評價增加;當溫度過高,部分木瓜蛋白酶發(fā)生變性失活,導致剪切力增加,牛肉也由于部分蛋白質(zhì)變性而老化,感官評價下降[11]。

圖3 處理溫度對剪切力和感官評價的影響Fig.3 The influence of treatment temperature on shear force and sensory evaluation

2.1.4 處理時間對牛肉嫩化的影響 由圖4可以看出,隨著處理時間的增加,剪切力和感官評價變化趨勢與酶濃度類似,當處理時間為2 h時,剪切力為22.82 N,感官評價達到最高,為81.30分;當處理時間為3.5 h時,剪切力最低,為6.13 N,感官評價為67.20分。處理時間過短,牛肉嫩化不夠,處理時間過長,牛肉的完整性又會被破壞,導致感官評價降低[14]。綜上所述,選擇酶濃度0.08%、pH6.5、處理溫度55 ℃,處理時間2.0 h較為合適。

圖4 處理時間對剪切力和感官評價的影響Fig.4 The influence of treatment time on shear force and sensory evaluation

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果 單因素實驗結(jié)果可以看出:剪切力和感官評價的變化趨勢不完全相關(guān)。當剪切力最低時,感官評價并不是最高的;但是感官評價最高時,剪切力均較低,因此,采用感官評價為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化,實驗結(jié)果見表3。

表3 牛肉嫩化的Box-Behnken實驗結(jié)果Table 3 The results of Box-Behnken experiment for beef tenderness

2.2.2 模型的建立及方差分析 應(yīng)用Design Export 8.0軟件對響應(yīng)值和各因素進行回歸擬合,得到木瓜蛋白酶嫩化牛肉工藝中感官評價(Y)與酶濃度(A)、pH(B)、處理溫度(C)、處理時間(D)這4個因素之間的二次回歸方程:

Y=-773.28333+6649.58333A+250.08333B-9.56500C+26.18333D-295.00000AB-40.50000AC+372.50000AD+2.29000BC+7.70000BD-0.57000CD-21406.25000A2-27.60000B2-9.00000E-003C2-19.05000D2

以感官評價為響應(yīng)值,根據(jù)表3實驗結(jié)果,應(yīng)用Design Export 8.0軟件對牛肉嫩化工藝的模型進行回歸分析,結(jié)果見表4。

從表4可以看出,回歸模型p<0.0001,說明構(gòu)建的模型極顯著。失擬項p>0.05,失擬不顯著,說明該方程可以很好的描述各嫩化條件和牛肉感官評價的關(guān)系。該模型決定系數(shù)R2=0.9645,表明該模型可以解釋響應(yīng)面中96.45%的可變性,可以用于牛肉嫩化的優(yōu)化。根據(jù)F值大小可知,影響感官評價因素的主次順序為:pH(B)>酶濃度(A)>處理時間(D)>處理溫度(C),其中一次項中因素A、B對感官評價影響極顯著(p<0.01),交互項中AC、BC、AD對感官評價影響極顯著(p<0.01),AB對感官評價影響顯著(p<0.05),平方項中A2、B2、D2對感官評價影響極顯著(p<0.01)。

2.2.3 響應(yīng)曲面及等高線分析結(jié)果 對構(gòu)建的回歸模型進行響應(yīng)面分析,考察了各因素間交互作用與響應(yīng)值之間的響應(yīng)曲面圖,結(jié)果見圖5。從圖5可以看出:等高線的中心區(qū)域,感官評價最高,由中心向邊緣逐漸降低,這和陶瑞等[15]的研究結(jié)果一致。pH與處理溫度的響應(yīng)曲面最為陡峭,說明兩者之間交互作用對感官評價的影響最為顯著,固定處理溫度或pH,感官評價和另一個因素呈非線性增長,說明二者交互作用極顯著,這和夏軍軍等[14]的研究結(jié)果相同,酶濃度與處理時間及處理溫度之間關(guān)系也類似于pH與處理溫度。酶濃度與pH之間的交互曲面較為陡峭,等高線呈橢圓,固定酶濃度或pH,感官評價隨著另一因素的升高呈先升高后下降的趨勢,且變化較為明顯,這表明二者交互作用顯著,這與表4中回歸分析結(jié)果是一致的。

表4 牛肉嫩化二次多項式模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model for beef tenderness

圖5 各因素交互效應(yīng)對感官評價的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface curve of sensory evaluation affected by two-factor interactions

注:**表示差異極顯著(p<0.01),*表示差異顯著(p<0.05)。

表5 優(yōu)化前后牛肉的品質(zhì)變化Table 5 Quality changes of beef before and after optimization

注:與對照組比較,**表示差異極顯著(p<0.01),*表示差異顯著(p<0.05);表6同。對回歸方程進行偏導求解,得出感官評價最高,即牛肉嫩化的最佳條件為:酶濃度0.07%,pH6.92,處理溫度60.00 ℃,處理時間1.84 h,此時感官評價的預測值達到最大,為94.70分。

2.2.4 驗證實驗 為檢驗實驗的可靠性,同時方便實驗操作,采用酶濃度0.07%,pH6.9,處理溫度60 ℃,處理時間1.8 h進行3次驗證實驗,對優(yōu)化前后牛肉的品質(zhì)指標進行比較,實驗結(jié)果見表5。從表5可以看出,優(yōu)化前后持水率、烹飪失水率、剪切力、感官評價、硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性均有極顯著差異(p<0.01),優(yōu)化后感官評價達到94.20分,與模型預測值(94.70分)接近,較對照組提高了39.56%,持水率、彈性、內(nèi)聚性及咀嚼性較對照組分別提高了28.41%、18.10%、7.31%和16.46%,而烹飪失水率、剪切力和硬度分別較對照組降低了28.50%、54.50%和14.46%。張婷等[25]采用酶解、超聲波輔助酶解、微波輔助酶解等嫩化工藝處理牛肉,發(fā)現(xiàn)實驗組的剪切力、硬度、咀嚼性較對照組顯著降低(p<0.05),彈性、回復性無顯著差異(p>0.05)。明建等[26]研究了蛋白酶嫩化處理牛肉后對其物性的影響,發(fā)現(xiàn)不同蛋白酶處理后持水力較對照組顯著提高,而失水率、剪切力、咀嚼性、彈性等指標較對照組顯著降低。本研究結(jié)果與張婷及明建有相同之處,但是對于咀嚼性、彈性、回復力也有一些差異,造成這些結(jié)果差異可能與牛肉的品種及部位、酶的純度及活性、肉樣本身品質(zhì)、處理條件等因素有關(guān)?？梢钥闯?優(yōu)化后的牛肉食用品質(zhì)顯著提高,證明該模型可以用于很好的描述牛肉嫩化工藝。

2.3 木瓜蛋白酶嫩化牛肉的肌纖維結(jié)構(gòu)及小片化變化

肌纖維是構(gòu)成肌肉的基本單位,其密度越大、直徑越小表明牛肉的肉質(zhì)越嫩;而肌原纖維小片化指數(shù)(MFI 值)是衡量肌原纖維分解程度的指標,其值越大表明內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞越多。木瓜蛋白酶嫩化牛肉肌纖維結(jié)構(gòu)及MFI值如表6所示。

表6 木瓜蛋白酶嫩化牛肉肌纖維結(jié)構(gòu)及MFI值Table 6 Effect of the papain on the characteristics of beef myofibrils and MFI values

由表6可以看出,使用木瓜蛋白酶對牛肉進行處理,可以極顯著(p<0.01)增加牛肉的肌纖維密度及MFI值,并降低肌纖維直徑,這與施帥等[8]的研究結(jié)果一致。優(yōu)化后MFI值和肌纖維密度分別增加74.93%和20.96%,而肌纖維直徑降低29.89%。這可能是因為木瓜蛋白酶處理可以催化部分肌纖維的蛋白質(zhì)降解成較小的蛋白分子或多肽段,促進了肌纖維的小片化及肌纖維直徑的減小,肌纖維密度相應(yīng)增加。

3 結(jié)論

本研究采用單因素實驗和響應(yīng)面法對木瓜蛋白酶嫩化牛肉的工藝進行優(yōu)化。得到的響應(yīng)面模型效果極顯著(p<0.0001),得到最佳工藝條件為:酶濃度0.07%,pH6.9,處理溫度60 ℃,處理時間1.8 h。通過實驗驗證,牛肉的食用品質(zhì)在優(yōu)化后顯著提高(p<0.01),其感官評價為94.20分,較對照組提高了39.56%,而剪切力為21.49 N,較對照組降低了54.50%。可見,本研究構(gòu)建的模型準確可靠,與實驗擬合良好。初步機理研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶可以促進牛肉肌纖維的小片化,使牛肉肌纖維直徑減小,密度增加,從而使牛肉嫩度提高。本研究使其牛肉食用品質(zhì)得到顯著提高,為其生產(chǎn)加工提供一定的理論依據(jù)。

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