王艷，韓瑞麗，姜靜，姚立農(nóng)

有較多研究表明，腦啡肽-δ受體系統(tǒng)對線粒體有影響，本課題組前期已成功構(gòu)建前腦啡肽原PPENK-MIDGE-NLS基因載體，并證實該載體預(yù)處理能夠轉(zhuǎn)染心肌細胞、白細胞，并利用轉(zhuǎn)染后白細胞聚集于心肌缺血再灌注損傷后缺血區(qū)的特性，提高局部前腦啡肽含量，產(chǎn)生心肌保護效應(yīng)[1-2]。本實驗旨在進一步研究PPENK-MIDGE-NLS基因載體后處理對大鼠心肌缺血再灌注時線粒體的影響，探索腦啡肽心肌保護新方法，并闡明其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組成年雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體重250～300 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（軍）2012-0007。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，心電圖檢查及體溫正常。隨機分為假手術(shù)組（sham組，n=10）：開胸不阻斷冠狀動脈左前降支（LAD）血流，經(jīng)股靜脈注射生理鹽水1.5 ml；缺血再灌注組（I/R組，n=10）：阻斷LAD 30 min，再灌注前給予生理鹽水1.5 ml；PPENK-MLDGE-NLS載體組（PPENK組，n=10）及Control-MIDGE-NLS載體組（control組，n=10）：均阻斷LAD 30 min，再灌注前分別經(jīng)股靜脈注射PPENK-MIDGE-NLS基因載體200 μg/1.5 ml及control-MIDGE-NLS基因載體200 μg/1.5 ml。

1.2 主要儀器及藥品參考文獻[3-4]，利用MIDGE方式構(gòu)建綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的前腦啡肽原基因載體（PPENK-MIDGE-NLS）以及不攜帶前腦啡肽原基因載體（control-MIDGE-NLS）；戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）；大鼠cTnI ELISA試劑盒（上海西唐生物有限公司）；組織線粒體分離試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、ATP檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒均來自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 動物模型建立各組大鼠術(shù)前12 h禁食過夜，自由攝水。腹腔注射1%戊巴比妥40 mg/kg麻醉，氣管插管，正壓通氣，參數(shù)：吸氧濃度33%，吸呼比1∶1，頻率75～80次/min，潮氣量2～3 ml/kg，常規(guī)記錄肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。分離大鼠右側(cè)股靜脈，置入聚乙烯管。左心耳下緣3～4 mm處穿線結(jié)扎阻斷左冠狀動脈前降支（LAD）血流30 min，各組給藥后松開絲線恢復(fù)血管再灌注。再灌注24 h后，取標(biāo)本測相關(guān)指標(biāo)。缺血模型建立成功標(biāo)志：心外面發(fā)白，心電圖表現(xiàn)為ST段抬高和(或)T波高聳或弓背向上抬高；再灌注損傷標(biāo)志：心外膜恢復(fù)紅潤，ST段逐漸下降或T波恢復(fù)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 基因載體轉(zhuǎn)染后缺血再灌注后心肌組織表達PPENK-MIDGE-NLS基因載體是以增強型綠色熒光蛋白pEGFP-N1為載體，PCR擴增前腦啡肽原PPENK基因后的重組質(zhì)粒，綠色熒光蛋白表達間接反映基因載體轉(zhuǎn)染后前腦啡肽PENK蛋白表達情況。取左心室前壁缺血區(qū)制作冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝像。

1.4.2 基因載體轉(zhuǎn)染后缺血區(qū)腦啡肽含量測定取左室前壁心肌組織，預(yù)冷PBS清洗后冰上剪碎，混入3倍體積50%乙酸，100℃水煮沸10 min，4℃2000 r/min離心30 min，取上清液，采用放免法測定缺血區(qū)心肌組織亮氨酸-腦啡肽（L-ENK）含量。

1.4.3 血漿cTnI濃度測定分別取4組大鼠血液3 ml，4℃3000 r/min離心15 min分離血漿，-80℃冰箱凍存。采用OlympusAu2700全自動生化分析儀，用cTnI測定試劑盒檢測血漿cTnI濃度。

1.4.4 心肌MDA和SOD濃度檢測取左室前壁心肌組織制成10%組織勻漿，-80℃冰箱保存待測。采用化學(xué)比色法測定MDA和SOD含量。

1.4.5 線粒體膜電位檢測取左室前壁心肌組織，預(yù)冷PBS清洗后剪碎勻漿（0～4℃），按照組織線粒體分離試劑盒（中國碧云天公司）說明流程提取高純度線粒體，按線粒體膜電位檢測試劑盒（中國碧云天公司）說明書，用熒光酶標(biāo)儀掃描檢測聚合體（激發(fā)波長525 nm，發(fā)射波長590 nm）與單體（激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm），以紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的程度。

1.4.6 心肌組織ATP含量測定取左室前壁心肌組織，按100～200 μl/20 mg加入組織裂解液，勻漿裂解后，4℃120 00 r/min離心5 min，取上清，按ATP檢測試劑盒（中國碧云天公司）說明，熒光分光光度計檢測心肌組織ATP濃度。

1.4.7 心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察取左室前壁缺血區(qū)大小約1 mm×1 mm×1 mm左心室組織，2%戊二醛固定，漂洗、固定、脫水、包埋、切片、染色后，日立HT7700型透射電子顯微鏡下，觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗；對不滿足正態(tài)和方差齊性條件的，組內(nèi)及組間采用Kruskal-Wallis H檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPENK-MIDGE-NLS基因載體轉(zhuǎn)染后在缺血再灌注后心肌組織表達靜脈注射PPENK-MIDGENLS基因載體，并再灌注損傷24 h后，可見轉(zhuǎn)染后缺血區(qū)呈現(xiàn)綠色熒光表達。而control組心肌組織切片中未見綠色熒光蛋白的表達。見圖1。

2.2 基因載體轉(zhuǎn)染后缺血區(qū)亮氨酸腦啡肽含量 缺血再灌注24 h后，與sham組相比，I/R組、PPENK組及control組心肌缺血區(qū)L-ENK含量明顯下降（P＜0.05）。靜脈注射PPENK-MIDGE-NLS基因載體后，PPENK組相較I/R組，L-ENK含量升高（P＜0.05）。而control組較I/R組L-ENK含量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見圖2。

圖1PPENK-MIDGE-NLS基因載體轉(zhuǎn)染后在缺血再灌注后心肌組織表達

圖2 各組大鼠缺血區(qū)亮氨酸腦啡肽含量

2.3 血漿cTnI及心肌組織MDA、SOD含量再灌注損傷后24 h，I/R組血漿cTnI濃度較sham組明顯升高（P＜0.05)，而PPENK組血漿cTnI的含量較I/R明顯降低（P＜0.05），control組與I/R組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。再灌注損傷后，I/R組、PPENK組、control組的MDA含量明顯高于sham組，SOD含量明顯低于sham組（P＜0.05）；PPENK組的MDA含量明顯低于I/R組，SOD含量明顯高于I/R組（P＜0.05）；control組MDA含量及SOD組與I/R組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；control組MDA含量明顯高于PPENK組，SOD含量明顯低于PPENK組（P＜0.05）。見表1。

2.4 線粒體膜電位及心肌組織ATP含量測定缺血再灌注損傷24 h后，I/R組、PPENK組、control組缺血區(qū)心肌線粒體膜電位及心肌ATP含量均較sham組明顯下降（P＜0.05）；PPENK組較I/R組線粒體膜電位升高約20.69%（P＜0.05），心肌缺血區(qū)組織ATP含量升高11.68%（P＜0.05）；Control組線粒體膜電位及心肌組織ATP含量與I/R組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見圖3。

2.5 各種心肌細胞及線粒體超微結(jié)構(gòu)改變sham組心肌細胞肌原纖維規(guī)整，細胞結(jié)構(gòu)完整；線粒體排列整齊，膜完整，基質(zhì)密度適中，偶可見線粒體腫脹及嵴突紊亂；I/R組肌原纖維紊亂、斷裂，線粒體腫脹,基質(zhì)密度降低，嵴突紊亂，可見大量空泡化線粒體；PPENK組肌束基本完整，線粒體輕度腫脹,基質(zhì)基本完整，顆粒部分消失，少部分斷裂，可見散在線粒體空泡化分布；control組超微結(jié)構(gòu)改變與I/R組相似（圖4）。

3 討論

本實驗觀察到大鼠心肌缺血再灌注損傷模型再灌注24 h后，心肌缺血區(qū)L-ENK含量下降約59%，并伴隨著血漿cTnI濃度升高，表明內(nèi)源性ENK濃度的減少在缺血再灌注損傷過程中具有重要意義。本研究旨在尋找增加缺血區(qū)局部腦啡肽含量，從而改善心肌缺血再灌注損傷的新方法。

實驗探討PPENK-MIDGE-NLS基因載體后處理后24 h對I/R的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜脈注射PPENKMIDGE-NLS基因載體200 μg后，PPENK組可見缺血區(qū)大量綠色熒光表達，提示PPENK-MIDGE-NLS基因載體對心肌細胞具有轉(zhuǎn)染作用。相較I/R組PPENK組L-ENK含量增加，提示PPENK-MIDGENLS基因載體轉(zhuǎn)染后能提高缺血區(qū)心肌細胞L-ENK含量。同時心肌損傷指標(biāo)cTnI含量改善，提示基因載體PPENK-MIDGE-NLS后，可以通過提高缺血區(qū)局部腦啡肽含量，減輕心肌損傷。

表1 缺血30min再灌注24h后各組血槳cTnl及心肌MDA、SOD含量的變化(n=10）

圖3 各組心肌缺血區(qū)線粒體膜電位及心肌組織ATP含量比較

圖4 各組電鏡下心肌細胞及線粒體超微結(jié)構(gòu)改變

腦啡肽在缺血性疾病（如心肌缺血再灌注損傷、失血性休克等）中表現(xiàn)出明顯的保護作用。本實驗觀察到，給予PPENK-MIDGE-NLS基因載體后24 h，缺血區(qū)心肌組織氧化應(yīng)激損傷減輕，心肌損傷程度降低；并通過對線粒體功能及形態(tài)評估，發(fā)現(xiàn)給予基因載體能夠維持再灌注損傷后線粒體膜電位、提高心肌組織ATP含量，改善線粒體損傷程度。而PPENK-MIDGE-NLS載體可能通過以下作用機制，保護線粒體結(jié)構(gòu)及功能的完整，產(chǎn)生心肌保護效應(yīng)：增加局部心肌腦啡肽含量，誘導(dǎo)類冬眠作用，減輕心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)，保存能量，減輕因能量缺乏導(dǎo)致的線粒體崩解或凋亡；抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能完整[5]。

本實驗證實，靜脈注射200 μg PPENK-MIDGENLS基因載體后，能夠提高缺血區(qū)局部腦啡肽含量，減輕缺血區(qū)心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善心肌細胞及線粒體結(jié)構(gòu)，起到心肌保護作用。此為改善心肌缺血再灌注損傷提供了新思路，但仍需進一步深入研究。

[1]陳曦,徐學(xué)敏,姚立農(nóng),等.PPENK-MIDGE-NLS基因載體的構(gòu)建及其在活體大鼠的表達[J].生物工程學(xué)報,2015,31(2):258-268.

[2]姜靜，韓瑞麗，陳曦,等.前腦啡肽原基因轉(zhuǎn)染對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志,2017,38(5):390-396.

[3]宋麗華,張曉一,來麗娜,等.白藜蘆醇對心肌缺血再灌注過程中線粒體的保護[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2015,35(10):907-911.

[4]賀永貴,李王芳,伊紅麗,等.黃芪甲苷抑制GSK-3β活性介導(dǎo)大鼠心肌缺血/再灌注損傷作用的線粒體機制研究[J].中國藥理學(xué)通報,2014,30(3):402-406.

[5]樊海龍,趙凌,任玉蘭,等.針灸防治心肌缺血再灌注損傷的線粒體通路研究進展[J].世界中醫(yī)藥,2015,10(4):294-298.