趙詩(shī)惠,呂 亮,蔣志云,吳憶寧,吳 鵬,3,沈耀良,3* (1.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 蘇州 215009；2.江蘇省水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 蘇州 215009；3.江蘇省環(huán)境科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 蘇州 215009)

目前,廢水生物處理中的短程硝化是污水處理領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-2],而微生物在系統(tǒng)中的種群特征研究有待進(jìn)一步深入開(kāi)展.已有的研究表明,在污水處理系統(tǒng)活性污泥中AOB是占主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)菌群[3-4],可通過(guò)控制水力停留時(shí)間[5-6]、溶解氧[7-8]、pH值[9]、溫度[10-11]等因素使AOB大量富集以實(shí)現(xiàn)短程硝化[12].微生態(tài)系統(tǒng)的特征直接影響廢水處理的效果,因此,分析和研究微生物的特性十分重要,這不僅對(duì)短程硝化工藝的優(yōu)化和控制提供依據(jù),也為開(kāi)發(fā)新型短程硝化工藝具有很重要作用.

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以較精確的分析微生物多樣性,且廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)、功能菌分布特征等方面[13-14],如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、高通量測(cè)序和克隆測(cè)序等方法[15-19].高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代微生物種群鑒定技術(shù),具有分析結(jié)果準(zhǔn)確、高效和高靈敏度等特點(diǎn),在環(huán)境微生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛.本研究采用Miseq高通量測(cè)序手段對(duì)ABR-MBR組合工藝短程硝化過(guò)程中微生物種群豐度、多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群分布特征進(jìn)行分析,以期為短程硝化過(guò)程提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

圖1 ABR-MBR組合工藝實(shí)驗(yàn)裝置Fig.1 Schematic diagram of ABR-MBR setup

采用的ABR-MBR組合工藝試驗(yàn)裝置如圖1所示.該裝置由4個(gè)隔室的ABR反應(yīng)器和MBR好氧池耦合而成,均采用有機(jī)玻璃制成.ABR反應(yīng)器和MBR好氧池的有效容積分別為7.2L和3.6L,MBR好氧池底部采用微孔曝氣裝置.

1.2 試驗(yàn)水質(zhì)和接種污泥

試驗(yàn)用水為低C/N模擬生活污水,詳見(jiàn)表1.反應(yīng)器的接種污泥取自蘇州市某城市污水處理廠,為全程硝化污泥,硝化性能良好.ABR和MBR反應(yīng)器接種污泥MLSS分別約為28000mg/L和4000mg/L.

表1 ABR-MBR組合工藝進(jìn)水水質(zhì)Table 1 Characteristics of the influent wastewater in ABR-MBR process

1.3 ABR-MBR組合工藝的運(yùn)行

本研究的ABR-MBR反應(yīng)器運(yùn)行數(shù)據(jù)取自第41d～179d,根據(jù)運(yùn)行參數(shù)將試驗(yàn)分為9個(gè)階段(Ⅰ～Ⅸ)如表2所示.研究過(guò)程中,通過(guò)水浴加熱控制溫度為28～32℃、pH值為7.1～7.4、保持MBR溶解氧濃度為0.5～1mg/L.

表2 ABR-MBR組合工藝試驗(yàn)方案及運(yùn)行參數(shù)Table 2 Experimental schemes and parameter of ABR-MBR processes

1.4 水質(zhì)指標(biāo)的檢測(cè)和方法

反應(yīng)器運(yùn)行期間,定期采集水樣經(jīng)0.45μm中性濾紙過(guò)濾后,按照國(guó)家環(huán)保部規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法《水質(zhì)和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》[20]對(duì)COD、氨氮()、硝酸鹽氮()、亞硝酸鹽氮()和磷酸鹽()指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定分析.其中COD采用快速消解法,采用納氏試劑光度法,N采用紫外分光光度法,采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法,采用鉬銻抗分光光度法.為方便數(shù)據(jù)分析,定義亞硝酸鹽積累率(NAR)如式(1):

1.5 微生物多樣性的檢測(cè)和方法

樣品采集:為研究短程硝化系統(tǒng)中的微生物種群,在MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷為0.32、0.50、0.94kg/(m3·d)且穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)期,于MBR中部進(jìn)行取樣,污泥樣品對(duì)應(yīng)編號(hào)為M1、M2和M3.

總DNA的提取與PCR擴(kuò)增:采用FastPrep DNA提取試劑盒法(QBIOGENE,USA)DNA,完成基因組DNA抽提,并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA.PCR擴(kuò)增測(cè)序區(qū)域?yàn)?38F_806R,擴(kuò)增引物采用16S RNA基因V3～V4區(qū)通用引物(338F/806R).引物名稱(chēng)和引物序列分別是338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACT ACHVGGGTWTCTAAT).PCR正式試驗(yàn)采用TransGen AP 221-02:TransStartFastpfu DNA Polymerase,20μL反應(yīng)體系.全部樣本按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行,每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù),將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris_HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測(cè).參照電泳初步定量結(jié)果,將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor? -ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量,之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求,進(jìn)行相應(yīng)比例的混合.

Miseq文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序:1) Miseq文庫(kù)構(gòu)建:通過(guò)PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端并回收PCR產(chǎn)物;Tris-HCl緩沖液洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測(cè);氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段.2)Miseq測(cè)序:按照高通量測(cè)序平臺(tái)的操作說(shuō)明對(duì)形成的cDNA文庫(kù)進(jìn)行Miseq高通量測(cè)序,將測(cè)序得到的DNA序列進(jìn)行拼接,同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量控制,對(duì)區(qū)分樣品后得到的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類(lèi)單元(OUT)分類(lèi).并利用i-sanger生信分析云平臺(tái)對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行在線處理和分析.

生物多樣性和分類(lèi)學(xué)分析:將序列按照彼此的相似性歸為操作分類(lèi)單元(OTU),按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類(lèi),在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體,得到OTU的代表序列.為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息,采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析,分別在各個(gè)分類(lèi)水平:domain(域)、kingdom(界)、phylum(門(mén))、class(綱)、order(目)、family(科)、genus(屬)和species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成.通過(guò)單樣本的多樣性(Alpha多樣性)分析反映微生物群落的豐度和多樣性,如Chao指數(shù)、ACE指數(shù)可以反映群落豐富度;shannon指數(shù)、simpson指數(shù)和coverage指數(shù)可以反映群落多樣性.

2 結(jié)果與討論

2.1 ABR-MBR反應(yīng)器運(yùn)行狀況分析

由圖2可見(jiàn),在Ⅰ～Ⅶ階段,隨著MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷的提高,ABR-MBR反應(yīng)器中平均出水由24.1mg/L降為4.6mg/L,平均出水由2.5mg/L升至8.2mg/L,同時(shí)亞硝酸鹽積累率整體呈上升趨勢(shì),逐步向短程硝化轉(zhuǎn)變.在MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷為0.21～0.32kg/(m3·d)時(shí)(Ⅰ～Ⅲ),亞硝酸鹽積累率維持在10%～20%;縮短ABR水力停留時(shí)間,從而提高M(jìn)BR氨氮進(jìn)水負(fù)荷為0.36～0.50kg/(m3·d)(Ⅳ～Ⅵ),此時(shí)亞硝酸鹽積累率上升并接近40%;繼續(xù)縮短ABR水力停留時(shí)間為6h,MBR水力停留時(shí)間為3h,此時(shí)氨氮負(fù)荷為0.94kg/(m3·d),亞硝酸鹽積累率進(jìn)一步提高到60%以上,同時(shí)氨氮去除率穩(wěn)定在90%以上,即MBR實(shí)現(xiàn)了短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行.繼而通過(guò)調(diào)控MBR池中液位高度增加MBR水力停留時(shí)間為4h和5h(Ⅷ、Ⅸ),進(jìn)水氨氮負(fù)荷隨之降低,亞硝酸鹽積累率降低到40%甚至一度低于20%以下.由于較低的氨氮負(fù)荷使NOB的活性抑制減小,使較多的轉(zhuǎn)化為,導(dǎo)致亞硝酸鹽積累率降低[21],從另一個(gè)角度也說(shuō)明短程硝化過(guò)程受環(huán)境影響較大.侯?lèi)?ài)月等[22]對(duì)模擬無(wú)機(jī)城市污水采用SBR反應(yīng)器控制溫度在20～22℃,pH值在7.2～7.9,溶解氧在0.5～1mg/L,運(yùn)行至第80個(gè)周期,NAR達(dá)到90%,實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的短程硝化.本研究中,控制溫度為28～32℃、pH值為7.1～7.4、采用低溶解氧濃度(0.5～1mg/L)的運(yùn)行條件,逐步提高M(jìn)BR氨氮進(jìn)水負(fù)荷是ABR-MBR組合工藝實(shí)現(xiàn)短程硝化的主要原因.

圖2 不同MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷下、和NAR的變化Fig.2 Variations of 、 and NAR at different influent ALR

2.2 Miseq高通量測(cè)序結(jié)果分析

2.2.1 微生物種群多樣性分析 利用Miseq平臺(tái)對(duì)MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷分別為0.32、0.50、0.94kg/(m3·d)時(shí)的3個(gè)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序,分別獲得40201、38167、39827條優(yōu)化序列,將優(yōu)化序列在97%的相似性下進(jìn)行聚類(lèi),分別獲得409、512、588個(gè)OTU數(shù)(如表3).并且3個(gè)樣品的Coverage(物種覆蓋度)均大于99%,表明本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本中微生物的真實(shí)情況.

表3 MBR池微生物種群豐度和多樣性分析Table 3 Species abundance and diversity of microbial communities in the MBR

ACE指數(shù)和Chao指數(shù)是用來(lái)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù),反映微生物種群的豐富度,值越高表明微生物種群豐富度越高;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是用來(lái)估算樣本中微生物多樣性的指數(shù),Shannon值越大,說(shuō)明微生物種群多樣性越高,Simpson指數(shù)值越大,說(shuō)明微生物種群多樣性越低,同時(shí)也說(shuō)明優(yōu)勢(shì)微生物占總生物量的比例越大.

表3顯示,3個(gè)污泥樣品的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均為M2＞M3＞M1,結(jié)果表明,當(dāng)MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷為0.50kg/(m3·d)時(shí),系統(tǒng)中微生物種群的豐富度和多樣性均高于其他兩種情況.該條件提供給大量微生物適宜生長(zhǎng)的環(huán)境和基質(zhì),使大量微生物共存.此外,3個(gè)樣品的豐富度指數(shù)波動(dòng)變化較小,表明氨氮負(fù)荷對(duì)MBR池微生物種群的豐富度影響較小.另一方面,3個(gè)污泥樣品的Simpson指數(shù)為M3＞M2＞M1,結(jié)果表明,隨氨氮負(fù)荷升高,系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)微生物占總生物量比重逐漸增大,即優(yōu)勢(shì)微生物愈來(lái)愈明顯.當(dāng)MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷為0.940kg/(m3·d)時(shí)(污泥樣品為M3),MBR池中微生物種群多樣性呈較低水平,優(yōu)勢(shì)微生物種群比例較大且明顯.由于較高的氨氮進(jìn)水負(fù)荷為微生物提供較充足的基質(zhì)濃度,使Nitrosomonas菌逐漸富集, Nitrosomona菌可有效地將轉(zhuǎn)化為,同時(shí)亞硝酸鹽積累率穩(wěn)定在60%以上,但較低的氨氮負(fù)荷下優(yōu)勢(shì)微生物種群不明顯.因此,在不同氨氮負(fù)荷條件下,微生物種群的豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)均較高,使系統(tǒng)微生物結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,保證了ABR-MBR組合工藝的穩(wěn)定運(yùn)行.

2.2.2 門(mén)水平優(yōu)勢(shì)微生物種群分析 圖3給出了污泥樣品在門(mén)水平微生物種群組成,表明其具有較高的多樣性,且存在7～8個(gè)門(mén).主要包括變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、綠菌門(mén)(Chlorobi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)等,并以變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)微生物為主,二者的相對(duì)豐度比例約占73%～85%.除此之外,厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)是M2和M3特有的菌群.

圖3 微生物種群分類(lèi)(門(mén))的群落組成相對(duì)百分比Fig.3 Precent of microbial communities on phylun level

從中可知,變形菌門(mén)為3個(gè)污泥樣品中占比最大的菌群,豐度分別為60.04%、41.04%和67.77%,結(jié)果表明,變形菌門(mén)在系統(tǒng)中為優(yōu)勢(shì)菌群,這一結(jié)果與侯?lèi)?ài)月等的研究結(jié)果一致即變形菌門(mén)所占比例最大為35%.國(guó)內(nèi)外研究表明,大多數(shù)在生物脫氮及諸多污染物降解過(guò)程中起重要作用的微生物均歸屬于變形菌門(mén)[23-24].因此,測(cè)試結(jié)果也說(shuō)明MBR池中的污泥具有較好的生物脫氮及去除污染物的能力.其次為擬桿菌門(mén),在3個(gè)樣品中的豐度比例分別為19.67%、26.12%和16.53%.其常存在于城市或工業(yè)污水處理廠的活性污泥中,是一種特殊的細(xì)菌,包括糖的降解,并可能參與多糖和肽的轉(zhuǎn)化[25].厚壁菌門(mén)存在于M2和M3樣品中,所占比例為5.84%和1.60%,其主要以芽孢桿菌為主,另外含有少量的微桿菌和葡萄球菌,值得一提的是,芽孢桿菌具有促硝化作用,能夠降解廢水中的氨氮,因此具有較好的污水凈化能力[26].除此之外,硝化螺菌屬(Nitrospira)所在的硝化螺旋菌門(mén)在各個(gè)樣品中所占比例較小,而Nitrospira是絕大多數(shù)文獻(xiàn)中報(bào)道的在生物脫氮過(guò)程中占主導(dǎo)地位的亞硝酸鹽氧化菌(NOB)[27-28].

為進(jìn)一步探索脫氮微生物所在的變形菌門(mén)在不同MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷下微生物的分布特征,現(xiàn)對(duì)MBR池中變形菌門(mén)在綱分類(lèi)水平的分布特征進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表4.從中可知,3個(gè)樣品中β-變形菌綱(Bataproteobacteria)是變形菌門(mén)豐度最大的菌群,其占細(xì)菌總量的比例分別為51.64%、62.73%和57.05%.另外,β-變形菌綱中存在的部分反硝化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌在脫氮及污染物去除中起著重要作用[29].其次為γ-變形菌綱(Gamaproteobacteria),占比為26.53%、18.86%和18.24%,而δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)占比最低.

表4 MBR池中變形菌門(mén)微生物的群落組成相對(duì)百分比(%)Table 4 Precent of microbial communities on Proteobacteria in the MBR on class levle (%)

2.2.3 屬水平優(yōu)勢(shì)微生物種群分析 為進(jìn)一步闡明系統(tǒng)在運(yùn)行過(guò)程中微生物種群的變化情況,在屬的水平上對(duì)3個(gè)樣品的功能微生物及優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行分析.

如圖4所示,在屬分類(lèi)水平上,3個(gè)樣品中主要屬類(lèi)為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、甲基球菌屬(Methyloparacoccus)和Denitratisoma.其功能微生物為脫氮微生物,主要包括亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),硝化螺菌屬(Nitrospira)和Denitratisoma,還包括屬于β-變形菌綱的陶厄氏菌屬(Thauera)和硫桿菌屬(Thiobacillus)等反硝化菌.由于MBR池內(nèi)COD較低,同時(shí)存在充足的和,且存在曝氣不完全的缺氧微環(huán)境,為自養(yǎng)反硝化菌提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境.

圖4 微生物種群分類(lèi)(屬)的群落組成相對(duì)百分比Fig.4 Precent of microbial communities on genus leve

該短程硝化系統(tǒng)中,存在亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),無(wú)亞硝化螺菌屬(Nitrosospira),可以推斷AOB為Nitrosomonas,占總生物量的比例為4.62%～22.56%,且為優(yōu)勢(shì)菌種,而NOB為硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)的硝化螺菌屬(Nitrospira),所占比例為0.06%～2.12%.另外,侯?lèi)?ài)月等人的研究結(jié)果中AOB所占比例為22.5%,NOB僅為3.75%,證實(shí)了AOB的大量富集有利于短程硝化的實(shí)現(xiàn).這一結(jié)果與多數(shù)污水處理系統(tǒng)中占優(yōu)勢(shì)的AOB為Nitrosomonas,NOB所占比例較小的研究結(jié)果相吻合[30].系統(tǒng)中Denitratisoma具有反硝化性能,占總生物量的1.13%～5.27%.此時(shí),ABRMBR組合工藝的出水氨氮濃度低于2mg/L.因此,功能微生物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性保證了底物有效降解,同時(shí)為系統(tǒng)的處理效果提供了保證.

亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和硝化螺菌屬(Nitrospira)是脫氮系統(tǒng)中常見(jiàn)的亞硝化和硝化細(xì)菌.圖5給出了AOB和NOB的分布特征,在不同MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷下,其占總細(xì)菌的分布比例不同,當(dāng)氨氮負(fù)荷由0.21kg/(m3·d)的增加至0.94kg/(m3·d)時(shí),Nitrosomonas和Nitrospira占總生物量比例都在逐漸增加,相對(duì)來(lái)說(shuō),Nitrosomonas的增加幅度較大,而Nitrospira的增加幅度較小且以較低的豐度水平存在于系統(tǒng)中.在氨氮負(fù)荷為0.94kg/(m3·d)時(shí),Nitrosomonas占總生物量比例達(dá)到22.56%,Nitrospira占2.12%.此時(shí),亞硝酸鹽積累率達(dá)到60%以上,氨氮去除率穩(wěn)定在90%以上,結(jié)果表明短程硝化的實(shí)現(xiàn)來(lái)自于AOB的大量富集,而NOB的小幅度增長(zhǎng)不會(huì)影響短程硝化的實(shí)現(xiàn).

圖5 AOB和NOB分布特征Fig.5 Distribution characteristics of AOB and NOB

3 結(jié)論

3.1 在ABR-MBR組合工藝中,控制溫度為28～32℃、pH值為7.1～7.4、DO為0.5～1mg/L,逐步提高M(jìn)BR氨氮進(jìn)水負(fù)荷,可促進(jìn)AOB菌群大量富集,實(shí)現(xiàn)短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行.在氨氮負(fù)荷為0.94kg/(m3·d)時(shí),Nitrosomonas的相對(duì)豐度為22.56%,亞硝酸鹽積累率穩(wěn)定在60%以上.

3.2 該短程硝化系統(tǒng)中,AOB為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),無(wú)亞硝化螺菌屬(Nitrosospira),Nitrosomonas一直存在于MBR好氧池中并逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌種,而NOB為硝化螺菌屬(Nitrospira).當(dāng)MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷由0.21kg/(m3·d)升至0.94kg/(m3·d)時(shí),Nitrosomonas占總細(xì)菌比例由4.97%升高至22.56%,而Nitrospira占總細(xì)菌比例一直保持較低水平,僅為0.06%～2.12%.

3.3 ABR-MBR組合工藝中,亞硝酸鹽積累率與AOB的活性、相對(duì)豐度密切相關(guān).AOB的大量富集有利于短程硝化的實(shí)現(xiàn),NOB的小幅度增長(zhǎng)不會(huì)影響短程硝化的實(shí)現(xiàn).

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