胡靖鋒，蘭 梅，徐學(xué)忠，楊紅麗，張麗琴，劉家佳，趙 穎，和江明*

體細(xì)胞融合、花藥培養(yǎng)、小孢子培養(yǎng)等再生植株都需要進(jìn)行倍性鑒定，常用的方法包括流式細(xì)胞儀檢測(cè)［1－2］、植株形態(tài)學(xué)觀察［2］、根尖染色體計(jì)數(shù)［3］等。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是費(fèi)用較高，不易普及；植株形態(tài)學(xué)觀察周期較長(zhǎng)，易受環(huán)境等因素影響；根尖染色體計(jì)數(shù)程序較復(fù)雜，且需具有一定理論基礎(chǔ)和熟練的操作才能獲得可靠的結(jié)果，不易大量使用。而利用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞及葉綠體數(shù)目鑒定植株倍性是一種既經(jīng)濟(jì)又有效簡(jiǎn)便的鑒定方法。目前，在大麥［4］、辣椒［5］、枇杷［6］、何首烏［7］等作物上已有相關(guān)的研究。本研究通過(guò)對(duì)不同十字花科作物葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)及葉綠體數(shù)目與其倍性關(guān)系的研究，分析它們之間的差異，找到一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確鑒定十字花科作物倍性的方法，為十字花科作物倍性鑒定提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

由云南省農(nóng)科院園藝所提供的試驗(yàn)材料是油菜材料 N001、N002，青梗菜材料 CPC001、CPC002，春菜材料KC01；以及油菜材料、青梗菜材料、春菜材料的小孢子培養(yǎng)再生植株N003、CPC003、KC02。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氣孔保衛(wèi)細(xì)胞橫縱徑及外周長(zhǎng)的觀察 當(dāng)植株有4～5片真葉長(zhǎng)出后，用鑷子小心撕下葉片下表皮，放到滴有一滴清水的載玻片上，用蓋玻片壓片后置光學(xué)顯微鏡下觀察。對(duì)同一葉片不同部位取樣時(shí)，將葉片分為上、中、下三等分，分別進(jìn)行取樣。通過(guò)目鏡測(cè)微尺測(cè)出縱徑、橫徑，并作記錄，計(jì)算葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞外圍周長(zhǎng)。

氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的外圍周長(zhǎng)（L）計(jì)算公式：

L＝1.57×［1.5×（A＋B）－（A×B）1／2］

公式中L為氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的外圍周長(zhǎng)，A、B分別代表整個(gè)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞橫、縱徑［8］。

1.2.2 氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目觀察 對(duì)各材料的單倍體、二倍體植株進(jìn)行葉片取樣，葉片取上、中、下3個(gè)部位，從第4片真葉完全長(zhǎng)出開(kāi)始，撕取樣葉的下表皮于載玻片上，并用1%碘－碘化鉀染色，加蓋玻片后，顯微鏡下計(jì)數(shù)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)目［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同十字花科作物二倍體植株葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)的比較

從表1可以看出，不同材料葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)之間存在差異。油菜N001的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)最大為75.47μm；其次是油菜N002，其氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)為72.06μm；青梗菜CPC001的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)為67.33μm；青梗菜CPC002的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)為62.86μm；春菜KC01的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)為65.82μm；CPC002的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)最小。通過(guò)方差分析，各研究材料間的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)差異顯著。

表1 不同十字花科作物二倍體植株葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)的比較 μm

2.2 不同十字花科作物單倍體植株葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)的比較

對(duì)油菜、青梗菜、春菜單倍體植株葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)進(jìn)行比較，結(jié)果表明（表2）：各材料的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)存在差異。N003的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)為50.74μm，CPC003的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)為47.47 μm，KC02的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)為44.21μm。在3種材料中，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)最大的是N003（油菜），其次是CPC003（青梗菜），KC02（春菜）的最小。通過(guò)方差分析，3種材料的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)之間差異顯著。

表2 不同十字花科作物單倍體植株葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)的比較 μm

2.3 單倍體與二倍體植株氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)的比較

以KC01、KC02為供試材料，對(duì)其植株氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明：春菜材料單倍體、二倍體植株的葉片上部、中部、下部間氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)大小差異不明顯，但單倍體與二倍體之間葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)大小差異比較明顯。KC01植株的葉片上部、中部、下部氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)分別是65.59、67.54、64.32μm，KC02植株葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)分別是 44.89、42.23、45.51 μm（圖 1）。 通過(guò)觀察葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)區(qū)別單倍體與二倍體植株較為簡(jiǎn)便。

圖1 單倍體與二倍體植株氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)比較

2.4 葉片不同部位氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目的比較

由表3可以看出，同一材料葉片不同部位氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目差異不明顯，各材料間的葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目不同，存在明顯差異。材料N001、CPC001、KC01的葉綠體數(shù)目均在10個(gè)以上，N003、CPC003、KC02的葉綠體數(shù)目均在10以下。經(jīng)方差分析，各材料的葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目差異顯著。

表3 不同材料葉片不同部位氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目的比較 個(gè)

2.5 不同倍性植株氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目的差異

對(duì)試 驗(yàn) 材 料 N001、N003、CPC001、CPC003、KC01、KC02進(jìn)行葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目觀察，試驗(yàn)材料間葉綠體數(shù)目存在差異，葉綠體數(shù)目分別為14、7、12、8、13、7 個(gè)。 二倍體材料為 N001、CPC001、KC01，單倍體材料為 N003、CPC003、KC02。 對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行葉綠體數(shù)目鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定，確定倍性比較鑒定結(jié)果一致性，說(shuō)明葉綠體數(shù)目鑒定植株倍性是可行的。

表4 不同倍性植株氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定的一致性

3 討論

利用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞鑒定植物倍性是一種便捷的方法，許多前人在多種作物上研究了氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度與倍性的關(guān)系。何婷等［10］對(duì)甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)的二倍體植株和小孢子來(lái)源再生單倍體植株的不同葉位葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞大小進(jìn)行了測(cè)定，考察了不同葉片的保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)軸長(zhǎng)、短軸長(zhǎng)以及其周長(zhǎng)差異，并對(duì)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞大小與植株倍性的相關(guān)性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：油菜單倍體與二倍體葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)軸長(zhǎng)、短軸長(zhǎng)以及其周長(zhǎng)存在顯著差異，利用長(zhǎng)軸與短軸長(zhǎng)度計(jì)算的周長(zhǎng)指標(biāo)對(duì)單倍體與二倍體鑒定具有更寬的區(qū)分窗口，可用于油菜雙單倍體群體構(gòu)建中植株倍性的快速鑒定。魯文英等［11］以飼用甜菜二倍體和四倍體為試驗(yàn)材料，研究了氣孔的長(zhǎng)、寬度與倍性的關(guān)系，結(jié)果表明：二倍體植株與四倍體植株的氣孔長(zhǎng)、寬度之間差異顯著?？勺鳛轱曈锰鸩硕啾扼w育種初期的篩選鑒定指標(biāo)。祁魏崢等［12］以流式細(xì)胞儀的結(jié)果為基準(zhǔn)，對(duì)再生植株葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周?chē)~綠體數(shù)目，保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)、寬及其周長(zhǎng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：在保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度和周長(zhǎng)均能說(shuō)明倍性的情況下，通過(guò)測(cè)量保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度來(lái)判定倍性更為簡(jiǎn)便。本研究對(duì)油菜、青梗菜、春菜單倍體及二倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞橫、縱徑及周長(zhǎng)進(jìn)行研究比較，單倍體和二倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞橫、縱徑、周長(zhǎng)數(shù)值差異顯著，且與前人研究結(jié)果相似。各研究作物間的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞橫、縱徑及周長(zhǎng)間也存在差異；各作物同一葉片不同部位氣孔保衛(wèi)細(xì)胞橫、縱徑及周長(zhǎng)間差異不顯著。

圖2 不同倍性植株葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目

在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目與倍性之間關(guān)系的研究方面，魯文英等［11］以飼用甜菜二倍體和四倍體為試驗(yàn)材料，研究了氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目與倍性的關(guān)系，結(jié)果表明：二倍體與四倍體植株的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目間差異顯著。施先鋒等［13］以二倍體西瓜及其同源四倍體為材料，通過(guò)觀察葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)來(lái)鑒定西瓜染色體倍性，結(jié)果表明：二倍性間的葉綠體數(shù)差異顯著。張凌媛等［14］以16個(gè)枇杷品種的二倍體和自然多倍體為試材，研究了氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目和氣孔密度與倍性的相關(guān)性，結(jié)果表明：氣孔密度與倍性相關(guān)性不顯著；多倍體氣孔葉綠體數(shù)比二倍體有明顯增多，差異均達(dá)極顯著水平，而多倍體之間差異不顯著；品種間葉綠體數(shù)有明顯差異，各品種葉綠體數(shù)分布有近似規(guī)律。閔子揚(yáng)等［15］以南瓜胚囊再生植株為材料，采用形態(tài)學(xué)鑒定法、根尖染色體計(jì)數(shù)法和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法3種方法對(duì)46株南瓜胚囊再生植株的倍性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明：形態(tài)學(xué)鑒定法只能作為倍性鑒定的一種輔助方法，而染色體計(jì)數(shù)法雖直接、準(zhǔn)確，但效率低，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法高效、簡(jiǎn)便。胡婷婷等［16］對(duì)粳稻F1代花培植株進(jìn)行倍性鑒定，結(jié)果表明：苗期利用印記液撕取法，觀察花培植株的氣孔形態(tài)、大小以及保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)并輔以形態(tài)學(xué)鑒定，是粳稻花培植株群體早期倍性快速判別的簡(jiǎn)單有效的辦法。本研究對(duì)各作物葉片不同部位保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目以及葉綠體計(jì)數(shù)與植株形態(tài)鑒定進(jìn)行比較，同一材料葉片不同部位氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目差異不明顯，各材料間的葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目差異明顯。保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)與植株形態(tài)鑒定倍性結(jié)果相吻合。另外，在植株倍性鑒定過(guò)程中，采用無(wú)菌水處理材料，更容易對(duì)葉綠體進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。

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