葛金濤，王麗麗，趙統(tǒng)利，劉興滿

微小 RNA（MicroRNAs）是一類非編碼小分子RNA，無論在植物還是動(dòng)物的生長發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［1］。miR159是已經(jīng)被證實(shí)的8個(gè)高度保守的miRNA之一，其在GA信號途徑中起到重要的調(diào)控作用［2］。

植物MiR159家族對應(yīng)的靶基因主要為MYB－like和MYB。研究表明在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有8個(gè)MYB基因受到miR159的調(diào)控，其中有7個(gè)屬于GAMYB家族［3］。另外，在擬南芥中，miR159通過間接調(diào)控靶基因MYB33、MYB65以及 MYB101來控制擬南芥的根長［4］；在擬南芥中過表達(dá) miR159a，其靶基因 MYB33和MYB65的表達(dá)量均呈下降趨勢，說明兩者均受到miR159a的調(diào)控；在水稻（Oryza sativa）中共有3個(gè)GAMYB－like的同源基因，靶基因預(yù)測結(jié)果表明，miR159與這3個(gè)基因均存在相互作用的位點(diǎn)；另外，在水稻中miR159的表達(dá)量與GAMYB－like1和GAMYB的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)［5］。在谷物絨氈層細(xì)胞中有較多的受GA調(diào)控的GAMYB蛋白，兩者相互作用共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡，在植物花藥及種子的發(fā)育中有重要的調(diào)控作用［6］。miR159的表達(dá)并非貫穿于水稻的整個(gè)生長發(fā)育過程中，在水稻種子階段未檢測到其表達(dá)情況。在GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，GA調(diào)控LFY基因的表達(dá)是通過作用結(jié)合在LFY基因啟動(dòng)子上的GAMYB作用元件實(shí)現(xiàn)的。另外研究表明，在短日照下施用GA可激活LFY基因的啟動(dòng)子活性，從而促進(jìn)植物開花［7］。大巖桐 miR159與SsGAMYB的相互作用影響了大巖桐的開花時(shí)間［8］。因此表明，miR159與其靶基因GAMYB轉(zhuǎn)錄因子之間的互作可能在植物種子萌發(fā)、成花誘導(dǎo)等過程中有重要的作用。

在金魚草（Antirrhinum majus L.）等植物的研究中發(fā)現(xiàn)，在植物花發(fā)育過程中，GA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是其中重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，而GAMYB是GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中關(guān)鍵作用因子，miR159通過介導(dǎo)其表達(dá)量間接發(fā)揮調(diào)控作用［9］。葡萄（Vitis vinifera）是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的果樹之一，但目前有關(guān)葡萄miR159和GAMYB的相關(guān)研究尚未見詳細(xì)報(bào)道。隨著生物信息學(xué)與分子生物學(xué)的快速發(fā)展，對植物全基因組數(shù)據(jù)中非編碼基因及其靶基因的挖掘、檢測、定位等已越來越成為研究的熱點(diǎn)。本研究利用生物信息學(xué)分析方法初步分析了葡萄miR159家族的系統(tǒng)發(fā)生規(guī)律、結(jié)構(gòu)預(yù)測、靶基因預(yù)測等，進(jìn)而推測其功能與葡萄生長發(fā)育過程之間的關(guān)系，以期從非編碼基因角度為今后葡萄的遺傳改良育種提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 序列獲得

在數(shù)據(jù)庫miRbase 21.0中下載葡萄、水稻、大豆（Glycine max）、碧桃（Prunus persica）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、番茄（Solanum lycopersicum）的miR159家族成員的成熟序列和前體序列。

1.2 vvi－miR159家族的基因定位

利用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST在線工具，在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中對其miR159前體序列進(jìn)行相似序列搜索（BLAST Assembled RefSeq Genomes）。根據(jù)最終的序列匹配結(jié)果，對葡萄miR159家族成員進(jìn)行基因組定位。

1.3 vvi－miR159家族進(jìn)化分析及堿基保守性分析

利用ClustalW2在線工具對相關(guān)miR159基因家族前體序列進(jìn)行比對。在WebLogo在線平臺輸入葡萄miR159家族的成熟序列，分析其堿基保守性，并繪制序列Logo圖。利用MEGA 6.0多序列比對結(jié)果，采用鄰近法（Neighbor－joining，NJ）構(gòu)建相關(guān)植物物種miR159家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，重復(fù)值設(shè)置為1000。

1.4 vvi－miR159家族前體二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

在RNAfold WebServer平臺上預(yù)測葡萄miR159家族成員的前體二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)，采用默認(rèn)參數(shù)值。

1.5 vvi－miR159家族的靶基因預(yù)測

通過psRNATarget平臺對靶基因進(jìn)行預(yù)測。提交葡萄miR159家族的成熟序列，選擇psRNATarget軟件中提供的葡萄JGI數(shù)據(jù)庫作為目標(biāo)基因搜索庫，采用默認(rèn)參數(shù)，預(yù)測其目標(biāo)基因；另外在GenBank中對目標(biāo)基因功能進(jìn)行注釋，初步確定其功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄miR159家族的基因定位

由表1可知，葡萄miR159基因主要分布于葡萄基因組的兩條染色體（Chr）上；其中 vvi－miR159a和vvi－miR159b均分布在 Chr15 上，而 vvi－miR159c分布于Chr17上。

表1 葡萄vvi－miR159基因家族的成熟序列及其基因定位

2.2 進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

建立基于水稻、葡萄等物種miR159家族的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖1）顯示：水稻osa－miR159和玉米zma－miR159家族成員分別聚類到一起；葡萄 vvimiR159家族3個(gè)成員（已標(biāo)注）中vvi－miR159a和vvi－miR159b聚類在一起，與大豆 gma－miR159家族成員的遺傳關(guān)系較近；而vvi－miR159c分布于另一個(gè)進(jìn)化分支上，與碧桃ppe－miR159聚類在一起，與葡萄家族的另外兩個(gè)成員間遺傳距離相對較遠(yuǎn)。結(jié)合vvimiR159基因定位結(jié)果，發(fā)現(xiàn)位于同一條染色體（Chr15）上的 vvi－miR159a 和 vvi－miR159b聚類在一個(gè)分支，而位于染色體（Chr17）上的 vvi－miR159c則聚類在較遠(yuǎn)的分支，兩者結(jié)果一致，符合植物基本進(jìn)化規(guī)律，同時(shí)也說明染色體間的miR159基因復(fù)制應(yīng)該早于同一條染色體上的基因復(fù)制。

2.3 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖2）表明，葡萄vvi－miR159家族成員的前體序列都可以形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且其3個(gè)成員的成熟序列都產(chǎn)生在其對應(yīng)前體序列的5′端臂上。

2.4 成熟序列堿基的保守性分析

對植物miR159的91個(gè)家族成員（圖3A）以及葡萄的3個(gè)家族成員（圖3B）的成熟序列進(jìn)行堿基保守性分析。結(jié)果表明，植物miR159家族的標(biāo)準(zhǔn)序列為 5′－UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA－3′，且在 2～20位堿基處保守性整體較高。葡萄vvi－miR159家族成員成熟序列的堿基種類基本上與標(biāo)準(zhǔn)序列一致（圖3B），其中vvi－miR159c的堿基種類與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致，vvi－miR159a和 vvi－miR159b成熟序列的堿基種類與標(biāo)準(zhǔn)序列基本一致，僅在第1、7以及21位堿基與標(biāo)準(zhǔn)序列存在差異（U轉(zhuǎn)為C；U轉(zhuǎn)為G；A轉(zhuǎn)為C）。說明葡萄miR159家族成員成熟序列的堿基保守性較高。

圖1 基于前體序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

2.5 靶基因預(yù)測結(jié)果

經(jīng)在線平臺預(yù)測，在葡萄 JGI基因庫中，vvimiR159家族成員都預(yù)測到有目標(biāo)基因存在，對應(yīng)的目標(biāo)基因有2個(gè)，分別為GSVIVT01012447001和GSVIVT01037362001（表2）。 在NCBI中通過 BLAST進(jìn)行功能預(yù)測，結(jié)果表明GSVIVT01012447001為GAMYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，而GSVIVT01037362001的功能目前尚未得到確認(rèn)。據(jù)此可初步推斷，葡萄miR159與其靶基因之間的互作在植物花期調(diào)控、根發(fā)育等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

圖3 植物miR159家族成員及葡萄miR159家族成員成熟序列的堿基保守性分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

自從Llave等［10］2002年首次在擬南芥中克隆到miRNA后，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅在植物應(yīng)對逆境脅迫反應(yīng)過程中有重要的調(diào)控作用，而且還參與調(diào)控植物的生長發(fā)育過程，包括植物葉片形態(tài)建成、花期［11］以及花器官［12］的變化等。 目前，主要有三類miRNA在植物開花過程中發(fā)揮主要作用，分別為miR172、miR159和 miR156。 這3種 miRNA是植物在成花期重要的調(diào)控因子，其中miR159主要通過GA信號途徑介導(dǎo)相關(guān)開花基因的表達(dá)［13］。

本文通過對葡萄vvi－miR159家族成員的前體序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與基因定位分析結(jié)果一致；另外對葡萄vvi－miR159的前體序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，對其成熟序列的堿基保守性以及目標(biāo)基因進(jìn)行分析預(yù)測，結(jié)果顯示，葡萄miR159家族成員的前體序列都可形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，且其對應(yīng)成熟序列的堿基基本上與miR159家族的標(biāo)準(zhǔn)序列保持一致，即植物miR159的成熟序列在不同物種中差異很小，這與李曉燕等［14］在大巖桐中的研究結(jié)果相同。靶基因預(yù)測結(jié)果表明葡萄miR159家族的主要目標(biāo)基因?yàn)镚SVIVT01012447001，經(jīng)功能預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)其為GAMYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，這與在大麥（Hordeum vulgare）、水稻［5］、擬南芥［15］、馬鈴 薯 （ Solanum tuberosum）［16］、草莓（Fragaria ananassa Duch.）［17］以及落葉松屬［18］植物中的研究結(jié)果相一致。

表2 葡萄miR159家族成員與其對應(yīng)的靶基因

但近期有實(shí)驗(yàn)表明，在短日照條件下，擬南芥miR159ab雙突變體中，MYB33和MYB65兩個(gè)基因的表達(dá)量都上調(diào)，開花時(shí)間出現(xiàn)了延遲現(xiàn)象，而在myb33－myb65突變體植株中，花期相對于野生型植株無變化；外施GA后，myb33－myb65功能缺失突變體表型也沒有發(fā)生變化，開花時(shí)間提前20 d左右，但miR159ab雙突變植株花期沒有變化，說明在擬南芥中MYB33和MYB65并不是控制開花途徑的關(guān)鍵基因。水稻gamyb突變植株在正常培養(yǎng)條件下，抽穗期和花期都未發(fā)生變化，據(jù)此表明GAMYB在植物花期調(diào)控中的作用較為復(fù)雜，仍有待于探索［19］。

另外，miRNA及其靶基因之間的調(diào)控是一個(gè)極為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)；另外，最新研究表明，circular RNA（環(huán)形RNA）中富含miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，可在細(xì)胞中結(jié)合相應(yīng)的miRNA，從而影響miRNA靶基因的表達(dá)水平［20］。本研究中發(fā)現(xiàn)葡萄 vvi－miR159的主要靶基因是GAMYB家族，但是葡萄vvi－miR159c對應(yīng)的靶基因功能尚未確定，因此葡萄miR159c是否還參與對其他類型的靶基因的調(diào)控，是否還參與葡萄其他生長發(fā)育的調(diào)控過程還有待進(jìn)一步確認(rèn)。此外，有相關(guān)研究［21］表明，植物miR159成熟序列5′端的第10和第11位堿基之間存在對目標(biāo)基因的剪切作用位點(diǎn)，但在葡萄中miR159的作用位點(diǎn)是否有時(shí)空與物種特異性，這有待深入探索分析。本文首次對葡萄vvimiR159家族進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析，并對其靶基因進(jìn)行了初步在線預(yù)測。今后仍有必要進(jìn)一步采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對葡萄vvi－miR159及其靶基因的功能與互作關(guān)系進(jìn)行更加深入的探討，從而從非編碼基因角度為今后葡萄新品種改良與選育提供新的參考。

［1］ Guo C，Xu Y，Shi M，et al.Repression of miR156 by miR159 regulates the timing of the juvenile－to－adult transition in Arabidopsis［J］.Plant Cell， 2017， 29（6）： 1293－1304.

［2］ Allen R S， Li J，Stahle M J， et al.Genetic analysis reveals functional redundancy and the major target genes of the Arabidopsis miR159 family ［J］.Proc Natl Acad Sci U S A， 2007（104）： 16371－16376.

［3］ Allen R S，Li J，Alonso－Peral M M，et al.MicroR159 regulation of most conserved targets in Arabidopsis has negligible phenotypic effects ［J］.Silence， 2010（1）： 18.

［4］ Xue T，Liu Z，Dai X，et al.Primary root growth in Arabidopsis thaliana is inhibited by the miR159 mediated repression of MYB33， MYB65 and MYB101 ［J］.Plant Sci， 2017， 262：182－189.

［5］ Tsuji H， Aya K，Ueguchi－Tanaka M， et al.GAMYB controls different setsof genes and isdifferentially regulated by microRNA in aleurone cells and anthers［J］.Plant J，2006，47（3）：427－444.

［6］ Aya K，Ueguchi－Tanaka M，Kondo M， et al.Gibberellin modulates anther development in rice via the transcriptional regulation of GAMYB ［ J］.Plant Cell， 2009， 21：1453－1472.

［7］Achard P，Herr A，Baulcombe D C，et al.Modulation of floral development by a gibberellin－regulated microRNA ［J］.Development， 2004， 131： 3357－3365.

［8］ Li X，Bian H，Song D，et al.Flowering time control in ornamental gloxinia （Sinningia speciosa） by manipulation of miR159 expression ［J］.Annals of Botany，2013，111： 791－799.

［9］ Millar A A， Gubler F.The GAMYB like genes MYB33 and MYB65，are microRNA regulated genes that redundantly facilitate anther development ［J］.Plant Cell，2005，17： 705－721.

［10］Llave C，Xie Z，Kasschau K D，et al.Cleavage of scarecrow－like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA［J］.Science， 2002， 297（5589）： 2053－2056.

［11］ Vaucheret H，Vazquez F，Crete P，et al.The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development［J］.Genes Dev， 2004， 18： 1187－1197.

［12］ Kidner C A， Martienssen R A.The role of ARGONAUTE1（AGO1） in meristem formation and identity ［J］.Dev Biol，2005， 280： 504－517.

［13］ Li Y，Alonso－Peral M， Wong G， et al.Ubiquitous miR159 repression of MYB33／65 in Arabidopsis rosettes is robust and is not perturbed by a wide range of stresses ［J］.BMC Plant Biol， 2016， 16（1）： 179.

［14］李曉燕.MiR159和miR172表達(dá)對大巖桐花發(fā)育的調(diào)控作用及其機(jī)理研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2012.

［15］Palatnik J F， Wollmann H， Schommer C， et al.Sequence and expression differences underlie functional specializaton of Arabidopsis microRNAs miR159 and miR319 ［J］.Dev Cell，2007， 13： 115－125.

［16］ Yang J，Zhang N，Mi X，et al.Identification of miR159s and their target genes and expression analysis under drought stress in potato ［J］.Comput Biol Chem，2014， 53： 204－213.

［17］Csukasi F， Donaire L， Casanal A， et al.Two strawberry miR159 family members display developmental－special expression patternsin the fruit receptacle and cooperatively regulate Fa－GAMYB ［J］.New Phytol， 2012， 195： 47－57.

［18］ Li W F，Zhang SG，Han SY，et al.Regulation of LaMYB33 by miR159 during maintenance in Larix kaempferi （Lamb.）［J］.Carr Plant Cell Tiss Organ Cult， 2013， 113： 131－136.［19］ Sun X， Zhang Y， Zhu X， et al.Advances in identification and validation of plant microRNAs and their target genes［J］.Physiologia Plantarum，2014，152：203－218.

［20］ Chu Q， Zhang X， Zhu X， et al.PlantcircBase： a database for plant circular RNAs ［J］.Mol Plant，2017， 10（8）：1126－1128.

［21］ Wang C， Han J， Korir N K，et al.Characterization of target mRNAs for grapevine microRNAs with an integrated strategy of modified RLM－RACE，newly developed PPM－RACE and qPCRs［J］.Journal Plant Physiology， 170： 943－957.