許建蘭，馬瑞娟，俞明亮，周 懋

桃屬于薔薇科（Rosacease）李屬，原產(chǎn)于我國，樹體適應(yīng)性強，結(jié)果早，見效快，栽培十分普遍［1］。我國是世界桃生產(chǎn)大國之一，資源豐富，分布廣泛。目前桃栽培品種繁殖主要通過嫁接技術(shù)，而病毒也主要靠嫁接（芽接、切接）傳染，據(jù)報道，病毒對桃樹的危害已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重。目前已發(fā)現(xiàn)的核果類果樹病毒病共161種，我國鑒定明確的核果類果樹病毒及其類似病害有15種，其中桃3種［2］。由于桃樹體高大，田間保存占用大量人力、物力、財力，有限的土地資源難以滿足人們的需求，加之，近些年氣候復(fù)雜變化，給資源保存也帶來一定困難。而組織培養(yǎng)技術(shù)可以在不受任何外界條件限制下進行種質(zhì)保存，還可研究被培養(yǎng)植物的生長和分化的規(guī)律，并且可以利用各種培養(yǎng)條件影響它們的生長和分化。離體保存占用空間小、繁殖速度快、管理方便，且有利于獲得脫除病毒的整齊一致的苗木。

國內(nèi)外學(xué)者對桃的離體分化培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化作了不少研究，但較多是關(guān)于組織快繁技術(shù)［3－6］，而桃遺傳轉(zhuǎn)化研究的工作進展緩慢。轉(zhuǎn)基因是目前改良植物遺傳特性，創(chuàng)造新品種的一項新技術(shù)。建立一個高頻率的離體再生體系是基因轉(zhuǎn)化的重要途徑。而再生植株的獲得需經(jīng)過愈傷分化，為獲得高頻再生體系，首先需誘導(dǎo)出大量愈傷進而分化出芽。由于桃再生困難，再生方面的研究報道較少且主要是關(guān)于砧木品種，以轉(zhuǎn)基因為目的的高效再生體系目前尚未建立。

栽培品種與砧木品種相比無論在樹體性狀還是再生能力方面均存在較大差異。桃屬于無性繁殖難生根樹種，在組織培養(yǎng)和扦插過程中均存在生根率低的問題［7］。霞暉6號是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的中熟桃新品種，近年來在江蘇、山東、浙江等省推廣應(yīng)用。本試驗以霞暉6號為研究對象，開展桃快繁體系的建立和愈傷誘導(dǎo)技術(shù)研究，為栽培品種的遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料霞暉6號來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所試驗園，取一年生枝條（芽未萌動前），帶回實驗室用流水沖洗，后置組培室24℃水培催芽，隔天換一次水，每次剪去基部2～3 mm，直至枝條抽出葉芽。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得 外植體莖尖消毒參考許建蘭等［5］的方法進行，將準(zhǔn)備好的莖尖在實驗室流水沖洗2 h，然后用75%乙醇處理1 min，無菌水清洗5次，再用0.1%HgCl2消毒12 min，無菌水沖洗6次，將消毒好的莖尖接種到 MS＋6－BA 0.5 mg／L＋IBA 0.3 mg／L＋GA30.2 mg／L＋2.0%蔗糖＋5.0 g／L Agar培養(yǎng)基上進行初代培養(yǎng)。

1.2.2 基本培養(yǎng)基的篩選 選擇MS、WPM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加相同濃度和配比的6－BA 0.5 mg／L和IBA 0.3 mg／L，每種培養(yǎng)基接種30個外植體，30 d后觀察比較。

1.2.3 增殖培養(yǎng)條件的篩選 根據(jù)1.2.2試驗結(jié)果，選擇MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同種類、濃度的外源激素 6－BA（0.5、1.0、2.0、4.0 mg／L）、IBA（0.5、1.0 mg／L）進行配比，每個處理接種10瓶，每瓶接種3個外植體，重復(fù)3次，30 d后比較增殖生長情況。

1.2.4 MS及改良MS對生根的影響 MS（大量元素減半）、MS（所有元素減半）與MS為基本培養(yǎng)基，分別加入相同種類、濃度的生長素進行生根培養(yǎng)基的篩選。

1.2.5 不同激素種類對生根的影響 根據(jù)1.2.4試驗結(jié)果，加入不同種類生長素NAA、IBA、IAA，濃度均設(shè)定為2.0 mg／L，進行生根比較。

1.2.6 不同蔗糖濃度對生根的影響 根據(jù)1.2.5試驗結(jié)果，分別加入不同濃度蔗糖（1%、2%、4%、8%），比較根系生長及玻璃化情況。

1.2.7 不同暗培養(yǎng)時間對生根的影響 根據(jù)1.2.6試驗結(jié)果，將接種生根苗直接光照培養(yǎng)、常溫暗培養(yǎng)1周、常溫暗培養(yǎng)2周、常溫暗培養(yǎng)3周后再進行光照培養(yǎng)，比較生根效果。

1.2.8 不同活性炭濃度對生根的影響 以MS＋IAA 2.0 mg／L為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度活性炭（0、0.05%、0.1%、0.5%），比較其生根效果。

1.2.9 愈傷的誘導(dǎo) 以MS為基本培養(yǎng)基，將不同濃度的 TDZ（1.0、3.0、5.0 mg／L）、IBA（0.2、0.5 mg／L）、2，4－D（1.0、2.0 mg／L）進行配比，共設(shè) 10 個不同處理。取植株頂部3～4片葉，在葉面劃傷口，然后進行接種培養(yǎng)，以葉片背面接觸培養(yǎng)基，先在4℃低溫下暗培養(yǎng)4周，后放入培養(yǎng)溫度為（23±1）℃、光周期為12 h／d的條件下進行培養(yǎng)。

1.2.10 褐化的防治 共設(shè)3個處理，不加任何抗氧化劑、加入 PVP（2.0 g／L）、加入 AgNO3（2.0 g／L）進行比較試驗。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS方差分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

以上處理除特殊說明外，則處理的蔗糖濃度為2.0%、瓊脂為 4.5 g／L、pH 值為 5.8、溫度 23 ℃、光照強度為3000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基的篩選

將消毒過的芽接種到WPM與MS兩種不同的基本培養(yǎng)基中，比較發(fā)現(xiàn)，接種初期兩者沒有太大的差別，但生長一個月后，可明顯看出MS培養(yǎng)基中生長的植株葉色較綠，而WPM培養(yǎng)基中生長勢較弱，葉色呈現(xiàn)淡黃色，說明MS培養(yǎng)基更適合其生長。

2.2 增殖培養(yǎng)基的篩選

從表1可以看出，隨著6－BA濃度的逐漸升高，增殖倍數(shù)呈顯著的上升趨勢。當(dāng)6－BA濃度為4.0 mg／L、IBA 濃度分別為0.5 mg／L 和1.0 mg／L 時，試管苗的增殖倍數(shù)分別為7.2和6.8，與其它處理達顯著差異水平，但增殖芽多呈叢生狀態(tài)，芽瘦小，生長較弱，且較高濃度細(xì)胞分裂素會加重玻璃化；當(dāng)6－BA濃度為0.5 mg／L時，試管苗葉色綠，葉片大而舒展，植株生長健壯，但增殖倍數(shù)低，不利于繼代擴繁；當(dāng)6－BA 濃度為 2.0 mg／L、IBA 濃度為 0.5 mg／L 時，試管苗既能保持較佳的生長狀態(tài)，又能維持較高的增殖倍數(shù)5.2，此組合適于試管苗的增殖培養(yǎng)。

2.3 MS及改良MS對生根的影響

以MS（大量元素減半）、MS（所有元素減半）與MS為基本培養(yǎng)基，分別加入NAA 2.0 mg／L進行生根培養(yǎng)基的篩選。表2結(jié)果顯示，MS（大量元素減半）的生根率最高，達18.3%，平均生根數(shù)最多，為1.68，高于MS（所有元素減半）培養(yǎng)基的生根率13.3%、平均生根數(shù)1.47和MS的生根率11.7%、平均生根數(shù)1.33；MS（大量元素減半）平均生根數(shù)與其它處理達顯著差異水平；所有處理均出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，但根部都產(chǎn)生了愈傷。

表1 不同激素的配比對增殖生長的影響

2.4 不同激素種類的濃度對生根的影響

以MS（大量元素減半）為基本培養(yǎng)基，加入不同種類、濃度的生長素NAA、IBA、IAA進行配比生根。從表3中看出，加入2.0 mg／L NAA的處理生根率及平均生根數(shù)最低，分別為18.3%與1.7；加入IAA處理的生根率和平均生根數(shù)相對較高。隨著IAA濃度的升高，生根率有所下降，當(dāng)IAA濃度為1.0 mg／L時生根率最高，為70.0%，但玻璃化率高達16.7%；當(dāng)IAA濃度提高到4.0 mg／L時生根率為50%；當(dāng)IAA濃度為2.0 mg／L時，生根率為53.3%，平均生根數(shù)為2.1，且根部無愈傷產(chǎn)生。比較發(fā)現(xiàn)，加入NAA、IBA在誘導(dǎo)生根時，切口基部都有愈傷產(chǎn)生，而加入IAA的處理在生根時基部無愈傷產(chǎn)生，有利于移栽。綜合比較，說明IAA是生根首選激素，濃度控制在2.0 mg／L較適合。

表2 不同基本培養(yǎng)基對生根的影響

表3 不同激素種類、濃度對生根的影響

2.5 不同蔗糖濃度對生根的影響

隨著蔗糖濃度不斷升高，生根率有不斷下降的趨勢，當(dāng)蔗糖濃度為1%時生根率最高，為56.7%，但玻璃化率高達27.8%，與其它處理達顯著差異水平。當(dāng)蔗糖濃度提高到8%時，生根率只有16.7%，玻璃化率為6.7%，但平均生根數(shù)最多，為3.3；當(dāng)蔗糖濃度為2%時，生根率為53.3%，平均生根數(shù)為2.1，與加入1%蔗糖的處理差異不顯著，與其它兩個處理達顯著差異水平（表4）。比較發(fā)現(xiàn)，所有處理根系均無愈傷生長，說明不同蔗糖濃度對愈傷產(chǎn)生并無明顯影響。

表4 不同蔗糖濃度對生根的影響

2.6 不同暗培養(yǎng)時間對生根的影響

從表5中看出，接種后先經(jīng)過暗培養(yǎng)再光照培養(yǎng)的處理生根率均有所下降；接種后直接常溫光照培養(yǎng)的處理生根率最高，達53.3%，平均生根數(shù)最多，為2.1；進行暗培養(yǎng)后生根率都有不同程度下降，暗培養(yǎng)3周時，生根率下降到25%，且根部會產(chǎn)生少量愈傷，不利于生根；在暗培養(yǎng)2周時生根率為45%，玻璃化率顯著提高到9.1%，而其它處理無玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生。

表5 不同光照培養(yǎng)時間對生根的影響

2.7 不同活性炭濃度對生根的影響

從表6可知，隨著活性炭濃度的不斷升高，生根率也不斷下降，在不加活性炭的處理中生根率最高，為36.7%，與其它處理達顯著差異水平，平均生根數(shù)達2.0，無玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生；在加入0.5%活性炭的處理中生根率下降到5%，平均生根數(shù)與加入0.1%活性炭的處理相當(dāng)，為1.0；比較發(fā)現(xiàn)，加入活性炭并不有利于生根，也未對玻璃化有所緩解，且發(fā)現(xiàn)所有處理根部均無愈傷產(chǎn)生。

2.8 愈傷的誘導(dǎo)

接種好的培養(yǎng)皿先在低溫5℃下培養(yǎng)4周，拿出冰箱時葉片顏色鮮綠，傷口無變化。光照培養(yǎng)9 d后傷口開始膨大，其中以葉柄處較為明顯。葉片接種方式對愈傷產(chǎn)生沒有明顯影響，可以從葉面產(chǎn)生，也可以從葉背產(chǎn)生。培養(yǎng)前期愈傷生長較慢，到第3周時愈傷生長較快。比較發(fā)現(xiàn)，在同樣濃度的TDZ和IBA中，加入2，4－D的處理中愈傷生長較多，致密，而沒有2，4－D的處理中愈傷相對較少，且以高濃度的TDZ和2.4－D利于愈傷的誘導(dǎo)，生長素濃度對愈傷誘導(dǎo)影響較小；處理E8和 E10中加入TDZ 5.0 mg／L和2，4－D 2.0 mg／L結(jié)果較為理想，其愈傷誘導(dǎo)率可達 100%（表 7）。

表6 不同活性炭濃度對生根的影響

表7 不同激素種類、濃度對愈傷誘導(dǎo)的影響

2.9 褐化的防止

褐化是抑制愈傷產(chǎn)生的重要原因，其中抗氧化劑對酚類物質(zhì)具有一定的抑制作用。本試驗對照中不加任何抗氧化劑，在愈傷生長初期無褐化現(xiàn)象，經(jīng)過4周的光照培養(yǎng)后，從傷口處開始褐化；加入AgNO3的處理，由于AgNO3見光易分解，分解物對葉片產(chǎn)生刺激作用，使葉片無法生長；加入PVP的處理具有較好的抗氧化作用，從愈傷誘導(dǎo)初期到愈傷長出，切口及愈傷均保持鮮綠。

3 討論與結(jié)論

不同培養(yǎng)基所含基本化學(xué)元素的種類和比例之間差異較大，選擇合適的基本培養(yǎng)基是離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)。本實驗初代將消毒過的芽接種到WPM和MS兩種不同的基本培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)生長一個月后，MS培養(yǎng)基中生長的植株較WPM培養(yǎng)基中植株葉色更綠，生長勢更強，可能由于MS培養(yǎng)基中含有較多氮元素，更有利于其生長。

針對不同的樹種、品種應(yīng)選擇不同的適宜培養(yǎng)基，而激素在所有因素中起關(guān)鍵作用。目前常用的激素很多，如 6－BA、KT、ZT、TDZ、NAA、IBA、IAA 等。植物生長處于一個動態(tài)變化過程，所以不同階段應(yīng)選擇適宜的激素種類和濃度，才能達到較好的效果。鐘士傳等［8］增殖用培養(yǎng)基 MS＋6－BA 0.5 mg／L＋NAA 0.1 mg／L，增殖系數(shù)為 6.9；莊麗娟等［9］的歐李試管苗增殖系數(shù)為4.99；孫新政等［10］用改良的培養(yǎng)基MS＋6－BA 2.0 mg／L＋NAA 0.02 mg／L＋GA30.2 mg／L，增殖系數(shù)達11.8，但經(jīng)過幾次繼代后有玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生。本試驗中，當(dāng)6－BA濃度達4.0 mg／L時，增殖系數(shù)在6.8以上，但易玻璃化，有效芽數(shù)量明顯減少，與前人報道的結(jié)論［11－13］一致。 可能是由于高濃度 6－BA 導(dǎo)致組培苗內(nèi)源激素比例失調(diào)，從而產(chǎn)生玻璃化，所以在誘導(dǎo)不定芽時配置好細(xì)胞分裂素與生長素的關(guān)系才能獲得健壯一致的芽。植物在不同生長階段所需激素種類不同，生長素更利于促進生根，但不同植物所需種類及濃度不同［7－10，14］，本試驗中加入 2.0 mg／L IAA更利于霞暉6號的生根。

長苗和生根分別在兩種不同培養(yǎng)基中進行，本試驗中MS全量培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根率最高，但有效生根苗少；MS所有元素減半的培養(yǎng)基生根率最低，反映出霞暉6號試管苗生根對營養(yǎng)物質(zhì)需求的特點。這可能是因為過多或過少的營養(yǎng)物質(zhì)同時造成了滲透壓比高或低，進而改變了細(xì)胞生理狀態(tài)［15］，限制了細(xì)胞分裂。在本試驗中MS（大量元素減半）的基本培養(yǎng)基更適合桃生根，該結(jié)果與韓新柱等［16］發(fā)現(xiàn)棗在生根誘導(dǎo)時以1／2MS培養(yǎng)基為宜結(jié)果一致。試驗中發(fā)現(xiàn)如果生長素種類、濃度以及其它培養(yǎng)方式不合適，則都可能會導(dǎo)致愈傷組織產(chǎn)生，愈傷組織生根與組培苗的主莖沒有維管聯(lián)系，容易脫落，給后期移栽帶來一定的困難。當(dāng)MS為基本培養(yǎng)基時，生根率高達72.2%，但根系基部有愈傷，因此仍以MS（大量元素減半）更適合霞暉6號桃的生根誘導(dǎo)。

組織培養(yǎng)中常用的活性炭在誘導(dǎo)生根中有兩面性，一方面吸附培養(yǎng)基中的非極性物質(zhì)和色素等有害物質(zhì)而有利于生根［17－18］，另一方面，也會吸附生根所必需的生長激素及其他營養(yǎng)物質(zhì)而抑制生根［19］。本試驗在生根時加入一定質(zhì)量的活性炭后并未對生根起到促進作用，加入活性炭的處理生根率明顯低于不加活性炭的處理，可能是由于加入生長素濃度本身不多，活性炭加入后又吸附掉部分促進生根的生長素所致。有報道［20－21］在植物微繁殖中應(yīng)用抗氧化劑來抑制褐變，而提高芽誘導(dǎo)率?？寡趸瘎┓乐菇M織培養(yǎng)褐化主要是通過抑制酚類物質(zhì)氧化。本研究中加入抗氧化劑PVP具有較好的防褐化效果，而加入AgNO3的處理葉片生長不良，與前人報道結(jié)果一致［22］，可能與加入AgNO3濃度有關(guān)，具體有待進一步探究。

［1］左覃元，朱更瑞，王力榮.中國桃果產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀及展望［J］.果樹科學(xué)，1997，14（1）：61－63.

［2］蔡志翔，馬瑞娟，俞明亮，等.桃樹蘋果花葉?。ˋPMV）的RT－PCR 檢測［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）：42－44.

［3］尚敏克，姜國斌，尹偉倫，等.晚熟桃的離體組織培養(yǎng)［J］.遼寧林業(yè)科技，2002（3）：5－7，20.

［4］白美發(fā).桃樹的組培快繁試驗［J］.落葉果樹，2004（3）：7－8.

［5］許建蘭，周懋，馬瑞娟，等.帚形山桃離體快繁技術(shù)研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（10）：40－41.

［6］李佳瑩，俞明亮，馬瑞娟，等.三種桃砧木的離體快繁技術(shù)研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，25（3）：635－639.

［7］白曉燕，王力榮，王新衛(wèi)，等.桃砧木組織培養(yǎng)和扦插生根的解剖學(xué)觀察［J］.果樹學(xué)報，2015，32（1）：74－78.

［8］鐘士傳，王俠禮，于軍香，等.植物激素對鈣果組織培養(yǎng)的影響［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，36（1）：39－41.

［9］莊麗鵑，蘇福才.歐李試管苗的快繁［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，26（1）：16－19.

［10］孫新政，申順先，李慶偉，等.鈣果4號歐李組織培養(yǎng)技術(shù)研究［J］.果樹學(xué)報，2007，24（1）：80－83.

［11］高紅兵，唐曉杰，孟慶繁.高濃度6－BA誘導(dǎo)酸櫻桃苗的玻璃化苗內(nèi)源激素含量變化［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2006，19（4）：488－490.

［12］ Alababneh SS， Shiblir A.Cryop reservation of bitter almond（Amygdalus communis L.） shoot tips by encapsulation dyhydration and vitrification［J］.Advances in Horticultural Science， 2003， 17（1）： 15－20.

［13］ Curtiso F，Shettyk.Growth medium effects of vitrification，total phenolics， chlorophyll， and water content of in vitro propagated oregano clones［J］.Act Horticulturae，1996， 426：489－497.

［14］ 高相福.刺梨離體快繁研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，1994，7（2）：113－115.

［15］Etuenne H，Berger A，Carron M P.Wate stress of callusfrom heave brasiliensis during induction of somatic embryogenesis［J］.Physiologia Plantrum， 1991（82）： 213－218.

［16］韓新柱，王素心，張世荃，等.棗樹組織培養(yǎng)獲得再生植株［J］.林業(yè)科技通訊，1998（10）：28－29.

［17］卜學(xué)賢，陳維倫.活性炭對培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的吸附作用［J］.植物生理學(xué)報，1988，14（4）：401－405.

［18］劉用生，李友勇.植物組織培養(yǎng)中活性炭的使用［J］.植物生理學(xué)通訊，1994，30（3）：214－217.

［19］陳龍清，鞠慶坤.活性炭對幾種植物試管苗生根的影響［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，14（6）：600－602.

［20］張衛(wèi)芳，高疆生，歐勇慧，等.抑制核桃組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象初探［J］.落葉果樹，2003（3）：4－7.

［21］龐勇.果樹組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象的研究進展［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2004（1）：16－18.

［22］劉娟，湯浩茹，劉玲梅.AgNO3對梨葉片不定梢再生過程中抗氧化酶活性的影響［J］.果樹學(xué)報，2008，25（4）：467－472.