郝東，史瑾，王維，鄧晗，王俊，楊曉琳，趙金禮

（陜西慧康生物科技有限責(zé)任公司，陜西西安 710054）

角質(zhì)細(xì)胞生長因子（KGF-1）是成纖維母細(xì)胞生長因子家族（FGFs）的一員，又名成纖維細(xì)胞生長因子7（FGF-7）[1]，最早由Rubin等在胚胎肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)[2]，其特異性受體FGFR2Ⅲb僅表達(dá)于各種上皮細(xì)胞，所以KGF-1僅特異作用于上皮細(xì)胞。這一特性使得KGF-1蛋白藥物在給藥時定向性更好，同時也更加安全。KGF-1不由上皮表達(dá)，在胚胎中可被多種基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，對原腸等多種上皮組織的形成起重要作用[3]。該因子通過旁分泌的形式發(fā)揮其生理學(xué)作用[4]，在皮膚創(chuàng)傷愈合中起重要生理病理學(xué)作用[5]。

本研究以本公司畢赤酵母表達(dá)KGF-1發(fā)酵液為原料，純化得到純度大于90%的KGF-1，可用于進(jìn)一步工業(yè)化研究。

1 材料和方法

1.1 儀器

遼陽陽光三足式離心機(jī)（SSC600-NG）、0.22 μm除菌濾器、天津膜天膜中空纖維膜組件、武漢新力協(xié)力超濾膜組件、AKTA purifiers 100、北京六一電泳儀、日立HPLC 、C8層析柱（中科院大連化學(xué)物理研究所）。

1.2 試劑

十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸以及電泳相關(guān)試劑，均為國產(chǎn)分析純；去離子水；超純水；乙腈及三氟乙酸均為色譜純；SP Bio-sep FF（保賽恒成生產(chǎn)，批號：20170327）。對照品LYZ：Sigma Lysozme hunman（L1667）。

1.3 材料

陜西慧康生物科技有限責(zé)任公司20170817批KGF-1發(fā)酵液。

1.4 KGF-1分離

發(fā)酵液經(jīng)沉降式離心機(jī)2 000 r/min離心60 min進(jìn)行固液分離；收集上清，經(jīng)0.22 μm中空纖維膜過濾系統(tǒng)，去除殘余菌體、細(xì)胞碎片以及部分雜質(zhì)；收集0.22 μm濾出液用3 k卷式超濾膜超濾濃縮脫鹽。

1.5 KGF-1陽離子交換層析提純

（1）樣品處理。最終收集收集的濃縮液中加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH 6.0～6.5，電導(dǎo)1.5～2.0 mS/cm，配成上樣溶液備用。

（2）SPFF陽離子交換層析純化一。配制流動相A：pH 6.5的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.5～ 7.0，電導(dǎo) 1.5～ 2.0 mS/cm；流動相B：pH 6.5的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液、1mol/L NaCl，pH6.5～7.0。將（1）中的KGF-1樣品上SPFF層析柱，樣品上樣完成后，用A相平衡，100% B相洗脫為雜質(zhì)，上樣穿柱液為KGF-1。

（3）SPFF陽離子交換層析純化二。配制流動相A：pH5.0的20 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH 4.8～5.3，電導(dǎo)0.8～1.3 mS/cm；流動相B：pH 5.0的20 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，1 mol/L NaCl，pH 4.8～5.3；將（2）中的穿柱液加冰乙酸調(diào)節(jié)pH 4.8～5.3，電導(dǎo)0.8～1.3 mS/cm上SPFF層析柱，樣品上樣完成后，用A相平衡，8%B相洗脫為雜質(zhì)，15%B相洗脫為KGF-1。

1.6 Tricine-SDS-PAGE電泳檢測

KGF-1分子量為18.9 kD，故采用15%的分離膠分別對粗純樣品以及離子交換層析樣品進(jìn)行分析檢測，先40 V電壓60 min，再120 V電壓150 min。電泳完成后用固定液固定30 min，再用R250染色30 min，最后用脫色液脫色。

1.7 HPLC對KGF-1純度分析

采用HPLC對純化后KGF-1進(jìn)行純度分析，色譜柱為C8柱，流動相A為超純水+0.1%TFA；B相為已腈+0.1%TFA，色譜分析程序?yàn)?0%B→50%B 30 min。檢測波長為215 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 KGF-1分離

KGF-1發(fā)酵液先進(jìn)行離心固液分離，去除酵母細(xì)胞以及不溶性雜質(zhì)，再過0.2 μm中空纖維膜過濾系統(tǒng)，進(jìn)一步去除殘余菌體、細(xì)胞碎片以及部分大分子物質(zhì)等，最后用3 k卷式超濾膜超濾濃縮脫鹽出去部分小分子物質(zhì)。各部純化效果良好，除0.22 μm過濾截留端有微量損失外，其余過程基本無明顯損失，粗純的結(jié)果良好，結(jié)果如圖1所示。

圖1 KGF-1粗純電泳圖譜

2.2 陽離子交換層析提純

將3 k脫鹽濃縮后的KGF-1加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH 6.0～6.5，電導(dǎo)1.5～2.0 mS/cm，經(jīng)由SPFF陽離子交換收集穿柱樣品，掛柱洗脫雜質(zhì)，洗脫曲線如圖2所示，電泳結(jié)果如圖3所示。

圖2 陽離子交換層析一次洗脫曲線

圖3 KGF-1一次精純電泳圖譜

2.3 陽離子交換層析深度純化

將一次精純的穿柱樣品中加入冰乙酸，調(diào)節(jié)pH 4.8～5.3，電導(dǎo)0.8～1.3 mS/cm，上SPFF陽離子交換層析柱，8%B相洗雜后，15%B相洗脫KGF-1，經(jīng)電泳檢測分離得到的KGF-1分子量約為18.4 kD，洗脫曲線如圖4所示，電泳結(jié)果如圖5所示。

圖4 陽離子交換層析二次洗脫曲線

圖5 KGF-1二次精純電泳圖譜

2.4 HPLC純度分析

高效液相色譜分析表明，純化后KGF-1出峰時間為17.67 min。采用面積歸一法計(jì)算峰面積，得到KGF-1產(chǎn)品純度91.9%，KGF-1產(chǎn)品檢測色譜圖如圖6所示。

圖6 純化后KGF-1 HPLC圖譜

3 結(jié)論

本方法采用傳統(tǒng)的固液分離技術(shù)、過濾技術(shù)以及超濾技術(shù)得到KGF-1粗品，經(jīng)兩步陽離子交換層析得到純度為91.9%的KGF-1產(chǎn)品。目前國內(nèi)外對于KGF-1的研究較少，且大部分集中在對提高KGF-1的表達(dá)量的研究，而對KGF-1分離純化方面的研究鮮有報道，本工作初步建立了一種以超濾過濾技術(shù)粗純，陽離子交換層析技術(shù)精純的KGF-1高純度分離純化工藝，工藝進(jìn)一步優(yōu)化后，有望進(jìn)行高純度大規(guī)模的生產(chǎn)。

[1]宗憲磊,蔡景龍,姜篤銀,等.角質(zhì)細(xì)胞生長因子研究進(jìn)展[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2009(2):188-193.

[2]Rubin J S,Osada H,Finch P W.Purificatin and Characterization of a Newly Identified Growth Factor Specific for Epithelial Cells[J].Pro Natl Acad Sci USA,1989,86,(3):802-806.

[3]Marti G,Ferguson M,Wang J,et al.Electroporative Transfection with KGF-1 DNA Improves Wound Healing in a Diabetic Mouse Model[J].Gene Therapy,2004,11(24):1780-1785.

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