陳 雷

福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種高度接觸性傳染病，又稱豬藍(lán)耳病[1]。該病以繁殖障礙、呼吸道疾病、免疫抑制和持續(xù)性感染等為主要特征，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙及各階段豬的呼吸道癥狀[2-3]。該病于1987年首先在美國發(fā)現(xiàn)，隨后于1988年和1990年在加拿大和德國發(fā)生。1991年在荷蘭暴發(fā)PRRS，并迅速蔓延。中國臺灣于1991年發(fā)現(xiàn)該病，中國大陸于1996年發(fā)現(xiàn)該病，并成功分離到北美型毒株，2006年初，我國南方豬群中暴發(fā)以發(fā)病急、傳播快、高發(fā)病率和病死率等為特征的高致病性藍(lán)耳病，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了難以估量的損失[4]。2015年又出現(xiàn)新型變異株[5]。目前，PRRS在世界范圍內(nèi)流行，給各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了國際間生豬及其豬產(chǎn)品的貿(mào)易，已成為威脅全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一。

目前疫苗免疫仍然是該病的主要防控手段，但不同廠家的疫苗其免疫結(jié)果大相徑庭，筆者根據(jù)浙江某規(guī)模化豬場豬群生產(chǎn)成績、豬藍(lán)耳病的發(fā)病情況，并結(jié)合實驗室檢測結(jié)果及毒株的分子生物學(xué)信息，探討當(dāng)前該豬場豬藍(lán)耳病的流行特點(diǎn)及疫苗免疫與流行株之間保護(hù)力的關(guān)系，以期為豬藍(lán)耳病的有效防控提供臨床指導(dǎo)。

1 材料方法

1.1 豬場選擇及豬場背景 藍(lán)定抗使用5年生產(chǎn)成績穩(wěn)定的規(guī)模化豬場為浙江金華市某豬場，存欄母豬480頭，2012年使用福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司藍(lán)定抗至今，生產(chǎn)成績較為穩(wěn)定。其中2015年豬場暴發(fā)流行性腹瀉，損失仔豬近487頭。

該場的免疫疫苗有：豬瘟疫苗、偽狂犬疫苗、圓環(huán)疫苗、支原體疫苗、口蹄疫疫苗和藍(lán)耳疫苗。豬場的生產(chǎn)成績?nèi)缦拢ㄒ姳?）。

1.2 試驗材料 解剖亞健康保育豬4頭，采集脾臟、淋巴結(jié)、肺臟和其他病變組織，并送實驗室檢測。

1.3 試驗方法 以提取的樣品cDNA為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法（RT-PCR）對豬藍(lán)耳病病毒進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中GP5基因片段，在其保守區(qū)設(shè)計特異性引物對陽性樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 豬場2011-2016年生產(chǎn)成績

1.4 GP5基因生物信息學(xué)分析 用DNAstar軟件對陽性樣品GP5基因進(jìn)行核苷酸同源性分析，通過MEGA6.0構(gòu)建進(jìn)化樹，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果 檢測結(jié)果顯示：送檢的4份病料中有3份為陽性。對陽性樣品 （暫命名為ZJ-01株）進(jìn)行GP5基因擴(kuò)增，擴(kuò)增出大小約600 bp的目的條帶（見圖1）。

2.2 GP5基因生物信息學(xué)分析 遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的進(jìn)化樹分為兩大基因型：GenotypeⅠ,GenotypeⅡ。GenotypeⅡ分為5個亞群：以VR2332為代表株的Ⅰ亞群；以CH-1a為代表株的Ⅱ亞群；以HP-PRRSV為代表的Ⅲ亞群；以NADC30為代表株的Ⅳ亞群；以GM2重組株為代表株的Ⅴ亞群。ZJ-01株與ZJ1503株親緣關(guān)系較近，核苷酸同源性達(dá)93.7%；與QYYZ株、CM2株屬于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較近，同位于Ⅴ亞群（見圖2-圖3）。

圖1 GP5基因RT-PCR檢測結(jié)果

3 討 論

1）GP5基因核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，ZJ-01株與ZJ1503株親緣關(guān)系較近，同源性達(dá)93.7%。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，該流行株與QYYZ株、CM2株屬于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較近。其中QYYZ株、CM2株同來源于中國流行株與進(jìn)口的經(jīng)典疫苗株MLV的重組株。此外，該毒株與類NADC30株、經(jīng)典株、變異株的核苷酸同源性均不是很高，達(dá)85%左右，推測該毒株極有可能是經(jīng)典株與流行株的新重組株。

圖2 ZJ-01株GP5基因核苷酸同源性分析

圖3 ZJ-01株GP5基因遺傳進(jìn)化分析

2）這一結(jié)論與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院報道出現(xiàn)的豬藍(lán)耳病病毒的自然重組毒株結(jié)果相符合。2006年起，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物病原監(jiān)測與分子流行病學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊對我國豬繁殖與呼吸綜合征病毒的流行病學(xué)開展了持續(xù)大量的監(jiān)測工作，發(fā)現(xiàn)了輸入性的北美毒株與本地流行株發(fā)生自然重組現(xiàn)象。2015年，Zhao等[4]報道了具有高致病性的毒株JL580，指出該毒株為NADC30與Hp-PRRSV的重組株。Li等[6]報道了HNyc15為VR2332與CH-1a的重組病毒株。張洪亮等[7]對15株類NADC30株P(guān)RRSV進(jìn)行重組分析發(fā)現(xiàn)，除LNCH160407株外，其余14株均存在重組現(xiàn)象。PRRSV的重組現(xiàn)象已經(jīng)成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)之一，探討PRRSV重組株的有效防控方案迫在眉睫。

3）通過對豬場2011年保育豬成活率只有50%、免疫藍(lán)定抗后豬群處于穩(wěn)定狀態(tài)、臨床使用效果以及對ZJ-01株GP5基因的生物信息學(xué)分析，推測豬場自然重組毒株（ZJ-01株）的致病性既沒有高致病性藍(lán)耳病那樣有很大的危害，也沒經(jīng)典毒株那么溫和，其致病性介于兩者之間，所以，一定要引起足夠重視。免疫藍(lán)定抗弱毒活疫苗后，該豬場一直很穩(wěn)定，由此說明藍(lán)定抗對該自然重組毒株有很好的交叉免疫保護(hù)。

[1]Park C H,Hwi W S,Kang Ikjae,et al.A new modified live porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine improvesgrowth performance in pigsunder filed conditions[J].Clinical and Vaccine immunology,2014,21(9):1350-1356.

[2]郭寶清,陳章水,劉文興,等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病,1996,18(2):1-4.

[3]Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRSin China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS One,2007,2(6):e526.

[4]Zhao K,Ye C,Chang X B,et al.Importation and recombination are responsible for the latest emergence of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virusin China[J].JVirol,2015,89(20):10712-10716.

[5]高志強(qiáng),郭鑫,楊漢春,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒缺失變異株的基因組特征[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2005,36(6):578-584.

[6]Li Y Y,Ji G B,Wang J,et al.Complete genome sequence of an NADC30-Like porcine reproductive and respiratory syndrome virus characterized by recombination with other strains[J].Genome Announc,2016,4(3):330-336.

[7]張洪亮,張晶,李真,等.2016年我國部分地區(qū)類NADC30新亞群豬繁殖與呼吸綜合征病毒的遺傳變異分析 [J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2016,38(9):676-680.