丁寧，張瑤楠，李媛媛，閆麗，賈孟春，劉美玲*

(1.國家衛(wèi)生計生委科學技術(shù)研究所，國家衛(wèi)生計生委男性生殖健康重點實驗室，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730)

miRNAs是一類內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，成熟體長18～26 nt，主要通過與靶mRNA 的3’-UTR區(qū)堿基互補降解靶mRNA或抑制其蛋白翻譯而行使轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的功能。miRNA參與生物生長和發(fā)育等生命過程的各個環(huán)節(jié)，包括器官發(fā)育、物質(zhì)代謝、細胞分化、凋亡[1]等。miRNA在精子發(fā)生中的作用越來越受到人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在人和動物睪丸發(fā)育及精子生成等過程中起著重要的調(diào)控作用。Yu等[2]研究顯示，Tnp2 mRNA的3’UTR出現(xiàn)翻譯抑制是因為受到了miR-122分子靶向調(diào)控，其在成年小鼠睪丸組織中豐富表達，這些研究都提示miRNAs在精子發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用。近年來，很多研究顯示miRNA在睪丸組織中廣泛表達，參與調(diào)控精子發(fā)生過程，并且精漿游離miRNA可能作為男性不育診斷的新指標。Yan等[3]采用基因芯片技術(shù)對小鼠幼齡期(7 d)和成年期(56 d)睪丸中miRNA的表達譜進行了比較分析，有19種miRNA的表達存在顯著差異。研究證實miRNA對精子生成具有重要的調(diào)控作用，如：腫瘤抑制因子(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN) 可以負向調(diào)控原始生殖細胞(Primordial germ cells，PGCs)增殖，而PTEN是miR-19a和miR-19b的作用靶標。因此，miR-19a 和 miR-19b 可以通過調(diào)節(jié)PTEN 的表達而調(diào)控 PGCs 的增殖[4-5]。miRNA-17-92簇和 Mirn290-295簇在培養(yǎng) 3 d后的新生小鼠精原細胞中表達最豐富，說明在精子發(fā)生過程中這兩個miRNA 簇在調(diào)節(jié)精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)的增殖和早期分化起重要作用[6]。以上研究結(jié)果都提示miRNAs在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

Speedy/Ringo基因一類新的細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinase，CDK)激活因子，與細胞周期蛋白(Cyclins)沒有同源性，不依賴于細胞周期蛋白而激活CDK，在細胞周期調(diào)節(jié)中起到重要的作用[7]。目前為止，發(fā)現(xiàn)了至少5種Speedy/Ringo蛋白，分別命名為Speedy/Ringo A、B、C、D、E，Speedy/Ringo A、B、C均有一個約含133氨基酸的保守區(qū)，并且發(fā)現(xiàn)所有的Speedy蛋白家族在睪丸中都高表達，有些成員在其它組織中也有表達[8-9]。本課題組的前期研究結(jié)果[10-12]和近期的兩篇文獻[13-14]報道均表明Speedy A基因在精子發(fā)生過程起重要的作用。

為進一步研究Speedy A蛋白在睪丸發(fā)育/精子發(fā)生中的表達受哪些分子的調(diào)控，本研究采用生物信息學方法預測Speedy A可能結(jié)合的miRNAs，結(jié)合課題組前期通過深度測序建立的小鼠精原細胞和精母細胞miRNA數(shù)據(jù)庫篩選出候選miRNAs，再通過檢測不同發(fā)育時期小鼠睪丸組織中候選 miRNAs 及Speedy A的表達，選出與Speedy A表達變化趨勢負相關(guān)的miRNA作為進一步的研究對象。構(gòu)建Speedy A基因野生型和突變型雙熒光素酶報告載體，鑒定相關(guān)miRNA與Speedy A基因3’-UTR的生物靶向關(guān)系，為接下來研究Speedy A與相關(guān)miRNA的功能與作用機制奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

1.動物材料及細胞株：SPF級c57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。人腎上皮細胞293T購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。

2.主要試劑：TRIzol、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000(Invitrogen，美國)，miR-23b、miR-143、miR-345-3p、miR-881及內(nèi)參U6的引物均購自蘇州吉瑪有限公司，miR-23b mimics 及mimics NC購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素(Gibco，美國)，pmirGLO Vector、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega，美國)。

3.在線數(shù)據(jù)庫：NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)和TargetScan(www.TargetScan.org)、miRNA(www.microrna.org)、miRwalk(http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html)。

二、研究方法

1.信息生物學分析方法預測可能調(diào)控 Speedy A的候選 miRNAs：根據(jù)靶基因3’UTR mRNA 與miRNAs 序列堿基互補的原則，分別在TargetScan、miRNA和miRwalk這3個在線數(shù)據(jù)庫中篩選出且具有潛在調(diào)控Speedy A的候選miRNAs。

2.采用 Real-Time PCR 檢測候選 miRNAs、Speedy A在不同發(fā)育時期的小鼠睪丸及生殖細胞中表達變化，并作相關(guān)性分析：按照 Trizol 說明書提取小鼠7、14、21、35和64天睪丸組織細胞總RNA，進行濃度和純度檢測。用特異性莖環(huán)引物進行反轉(zhuǎn)錄(RT)，合成 cDNA，加入 SYBR Premix ExTaq，進行實時定量PCR 反應。實時定量PCR反應條件：95℃ 30 s，然后按95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個循環(huán)，95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，進行。以上各步驟中，反應體系以及試劑用量均嚴格按照說明書進行。候選miRNAs、Speedy A、Actin和U6 擴增引物序列(表 1)。

表1 候選 miRNAs、Speedy A 引物序列，分別以 U6、Actin 為內(nèi)參照

3.熒光素酶報告基因載體構(gòu)建：從 Ncbi中搜索到Speedy A基因 3’UTR 的序列，根據(jù)該段序列設(shè)計并合成涵蓋miR-23b作用位點的結(jié)合序列及其突變序列，長 467 bp，連接于pmirGLO載體上。并在引物內(nèi)引入保護堿基和XhoI、SalI酶切位點，由華大科技生物公司合成。引物序列為：上游引物：5’-CCGCTCGAGGTCTTCAGATTCAGTGCTG-3’；下游引物：5’-ACGCGTCGACGGCTTCTCCGTTTGGTTA-3’ (劃線部分為酶切位點)。雙酶切連有目的片段的Speedy A質(zhì)粒和 pmirGLO載體，回收458 bp 目的片段和 pmirGLO載體片段，16 ℃連接過夜。用感受態(tài)大腸桿菌TOP10轉(zhuǎn)化，挑取陽性單菌落搖菌，提取質(zhì)粒，并進行雙酶切 (XhoI、SalI) 鑒定。將含有正確目的序列的質(zhì)粒命名為野生型WT-Speedy A-3’UTR。以野生型為模板用點突變試劑盒Fast Mutagenesis System(全式金生物技術(shù)有限公司)將 miR-23b 與speedyA 3’-UTR 區(qū)域結(jié)合堿基突變?yōu)闊o意義序列，設(shè)計定點突變引物，上游引物：5’-TGTGGAAAATCAGAACGTCACGTGACTCTTC-3’，下 游 引物：5’-GTTCTGATTTTCCACAGACCATGT-AACGTGAC-3’(下劃線示突變后的序列)，具體操作參照說明書，將構(gòu)建成功的突變型質(zhì)粒命名為突變型，送上海英駿生物技術(shù)公司測序。

4.細胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染：293T細胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2，10%胎牛血清(FBS) 的DMEM培養(yǎng)基中。于轉(zhuǎn)染前 1 d接種適當1×105～1×106的 293T 細胞至24孔板中，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度能夠達到 60%～70%，并設(shè)置3個復孔。實驗組分為 4組，野生型實驗組：WT-Speedy A-3’UTR質(zhì)粒和miR-23b mimic；野生型對照組：WT-Speedy A-3’UTR質(zhì)粒和miR-23b mimic NC；突變型實驗組：mut-Speedy A-3’ UTR 質(zhì)粒和miR-23b mimic；突變型對照組：mut-Speedy A-3’ UTR質(zhì)粒和miR-23b mimic NC。參照 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的細胞置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4～5 h，換成新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后裂解細胞，檢測熒光素酶活性。

5.熒光素酶活性檢測：用 PBS 緩沖液洗滌轉(zhuǎn)染后細胞1-2次。吸除各孔內(nèi)的培養(yǎng)基，于各孔中加入1×細胞裂解液100 μl，裂解10-15 min，將細胞裂解液移至離心管內(nèi)，離心1 min。取上清液20 μl于新的離心管中，加入100 μl LARⅡ，檢測螢火蟲熒光素酶的活性，然后再向檢測管中加入100 μl Stop&Glo Reagent，檢測海腎熒光素酶活性，并計算兩者比值。

三、統(tǒng)計學分析

本研究采用聚類分析中常用的 pearson 相關(guān)系數(shù)評價 miRNAs 與 Speedy A負相關(guān)的顯著程度。相關(guān)統(tǒng)計分析由SPSS 15.0軟件完成，主要方法為χ2檢驗和方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異極顯著。

結(jié) 果

一、生物信息學方法預測調(diào)控Speedy A的候選miRNAs

通過TargetScan等3個數(shù)據(jù)庫工具，結(jié)合本實驗室前期建立的精原細胞和精母細胞小RNA數(shù)據(jù)庫篩，選出4個評分較高的候選miRNA：miR-23b、miR-143、miR-345-3p和miR-881。這4個候選miRNAs與靶基因 Speedy A 3’UTR mRNA的識別位點分別在 1 498-1 518 bp、1 269-1 290 bp、1 284-1 304 bp、1 674-1 695 bp。

二、候選 miRNAs 在不同發(fā)育時期小鼠睪丸組織中表達水平以及與 Speedy A相關(guān)性

實時定量PCR檢測4個候選 miRNAs及Speedy A在不同發(fā)育時期小鼠睪丸組織中表達變化。結(jié)果顯示miR-23b隨著小鼠睪丸的發(fā)育呈逐漸降低的趨勢，而Speedy A的表達量則逐漸上升，miR-23b、miR-345與Speedy A基因的表達趨勢呈現(xiàn)負相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=-0.9084和r=-0.8235)，而miR-143、和miR-881與Speedy A基因的表達無顯著相關(guān)性(圖1)。確定miR-23b為進一步研究的目標。

三、熒光素酶報告基因載體構(gòu)建

從 Ncbi(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索到Speedy A ID：70891基因 3’UTR 的序列(片段長度為467bp)，根據(jù)該段序列設(shè)計并合成涵蓋miR-23b作用位點的結(jié)合序列(AATGTGA)及其突變序列(AACGTGA)(圖2B)。通過PCR擴增野生型和突變型Speedy A 3’UTR，所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，將酶切產(chǎn)物進行跑膠(圖2A))并送公司測序鑒定，最終獲得野生型和突變型重組載體質(zhì)粒，說明雙熒光酶報告基因載體構(gòu)建成功。

四、Speedy A為miR-23b直接調(diào)控靶基因

為明確miR-23b是否直接調(diào)控Speedy A基因，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，miR-23b mimics可抑制野生型3’UTR報告載體熒光素酶活性，而對突變型3’UTR報告載體熒光素酶活性無明顯的抑制作用(t=23.4，P<0.01)(圖3)。

討 論

LM23 基因(AF492385)是本實驗室早期篩選大鼠精原細胞與精母細胞差異表達基因過程中發(fā)現(xiàn)的大鼠睪丸特異表達基因。研究發(fā)現(xiàn)該基因在精母細胞中表達豐度高，而在精原細胞和精子細胞中表達微量，提示其在精子發(fā)生過程中具有階段特異表達的特點[11]。BLAST工具對LM23基因的同源基因進行比對分析與小鼠的細胞周期相關(guān)基因speedy homolog A(Speedy A)具有很高的同源性達89%。為了研究LM23基因在睪丸發(fā)育/精子發(fā)生中的作用，本實驗室前期利用慢病毒為載體的活體RNA干擾技術(shù)，建立了大鼠睪丸LM23基因敲低的模型。組織學檢測LM23基因敲低的睪丸，發(fā)現(xiàn)精細小管中圓型精子細胞很少，幾乎沒有成熟的精子，精子發(fā)生阻滯在精母細胞階段。芯片篩選發(fā)現(xiàn)，許多與細胞周期及減數(shù)分裂有關(guān)的基因表達發(fā)生明顯的改變[15-17]。這些研究結(jié)果提示LM23基因(Speedy A)對生精細胞分化發(fā)育和精子形成起到重要調(diào)控作用。miRNA 在精子生成減數(shù)分裂和單倍體形成時期均發(fā)揮著重要的作用，然而這方面的研究卻還處于初步階段。因此，研究 miRNA 對精子生成的調(diào)控作用的意義重大。

A：RT-PCR檢測miR-23b及Speedy A在不同發(fā)育時期小鼠睪丸組織中的表達及相關(guān)性；B：RT-PCR檢測miR-143及Speedy A在不同發(fā)育時期小鼠睪丸組織中的表達及相關(guān)性；C：RT-PCR檢測miR-345-3P及Speedy A在不同發(fā)育時期小鼠睪丸組織中的表達及相關(guān)性；D：RT-PCR檢測miR-881及Speedy A在不同發(fā)育時期小鼠睪丸組織中的表達及相關(guān)性圖1 候選 miRNAs 及Speedy A在不同發(fā)育時期小鼠睪丸組織中的表達

生物信息學是生命科學領(lǐng)域中的新興學科，對于方興未艾的 miRNA功能研究，預先進行的生物信息學分析亦能為研究者提供較大的幫助，為后續(xù)的實驗提供思路，提高研究效率[18]。準確預測miRNA的靶基因并對其候選基因進行系統(tǒng)生物信息學分析是研究miRNA后續(xù)作用機制的關(guān)鍵所在。由于靶基因的種類和數(shù)量眾多，且靶基因參與調(diào)控的機制也比較復雜，所以通過生物信息學對miRNA進行分析，以預測 miRNA靶基因，正確認識miRNA與其靶基因的相互作用，對確定miRNA研究方向具有重要意義[19]。但是由于預測數(shù)據(jù)庫所采用的計算方法和預測側(cè)重的方向各有不同，將多個在線預測數(shù)據(jù)庫的結(jié)果進行比對，選取共同存在的結(jié)果，有助于提高生物信息學預測的準確性。本研究采用了miRNA等三個在線軟件進行了靶基因的預測。

為研究調(diào)控Speedy A基因表達的miRNA，我們根據(jù)本課題組前期建立的小鼠精原細胞和精母細胞的轉(zhuǎn)錄組和小RNA數(shù)據(jù)庫及生物信息學方法預測了4個可能調(diào)控Speedy A表達的miRNAs：miR-23b、miR-143、miR-345-3p及miR-881。但由于各種預測方法具有一定的局限性，所以對于生物信息學方法分析的結(jié)果還要進一步進行實驗驗證。本研究通過熒光定量PCR的方法檢測小鼠睪丸不同發(fā)育時期中以上四個miRNAs及Speedy A的表達量，發(fā)現(xiàn)miR-23b隨著小鼠睪丸的發(fā)育表達量逐漸降低，與Speedy A的表達呈顯著負相關(guān)。miR-23b是一個參與調(diào)節(jié)多種信號通路的多功能miRNA，其作用涉及增殖、分化、凋亡、細胞粘附等各個方面，而且關(guān)于其功能及作用機制的研究仍在不斷擴展。miR-23b在不同的癌癥中的表達情況和所起的作用不同，如在前列腺癌中，它是抑制癌細胞的增殖和遷移，而在乳腺癌中其促進癌細胞的轉(zhuǎn)移[20]。但是miR-23b在精子發(fā)生和成熟中的作用仍未見報道。因此，我們選擇miR-23b作為進一步研究對象。然后通過構(gòu)建野生型及突變型Speedy A 3’-UTR 雙熒光素酶報告質(zhì)粒及與miR-23b mimics 共轉(zhuǎn)染 293T 細胞，檢測熒光素酶活性，證實Speedy A是miR-23b的靶基因。本研究為探討Speedy A和miR-23b在精子發(fā)生中的作用及其調(diào)控，完善精子發(fā)生表觀遺傳調(diào)控分子機制提供了線索。

A：瓊脂糖電泳圖 M：DL2000 DNA Marker，1：wt-Speedy A 3’ UTR：野生型熒光素酶報告載體雙酶切產(chǎn)物，2：mut-Speedy A 3’ UTR：突變型熒光素酶報告載體雙酶切產(chǎn)物；B：結(jié)合位點示意圖 軟件預測 miR-23b與 野生型及突變型Speedy A 3’ UTR的結(jié)合位點示意圖圖2 wt/mut-Speedy A-3’UTR 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖及miR-23b的結(jié)合位點示意圖

1：野生型實驗組：WT-Speedy A-3’UTR質(zhì)粒和miR-23b mimic熒光素酶表達量；2：野生型對照組：WT-Speedy A-3’UTR質(zhì)粒和miR-23b mimic NC熒光素酶表達量；3：突變型實驗組：mut-Speedy A-3’ UTR 質(zhì)粒和miR-23b mimic熒光素酶表達量；4：突變型對照組：mut-Speedy A-3’ UTR質(zhì)粒和miR-23b mimic NC熒光素酶表達量。**P<0.01圖3 雙熒光素酶報告系統(tǒng)熒光素值比較

[1] 孟雅楠，孟麗軍，宋亞娟，等.小RNA分子與精子發(fā)生調(diào)控[J].遺傳，2011，33：9-16.

[2] Yu Z，Raabe T，Hecht NB.MicroRNA Mirn122a reduces expression of the posttranscriptionally regulated germ cell transition protein 2 (Tnp2) messenger RNA (mRNA) by mRNA cleavage.Biol Reprod[J]，2005，73：427-433.

[3] Yan N，Lu Y，Sun H，et al.A microarray for microRNA profiling in mouse testis tissues[J].Reproduction，2007，134：73-79.

[4] Kimura T，Suzuki A，F(xiàn)ujita Y，et al.Conditional loss of PTEN leads to testicular teratoma and enhances embryonic germ cell production[J].Development，2003，130：1691-1700.

[5] Moe-Behrens GH，Klinger FG，Eskild W，et al.Akt/PTEN signaling mediates estrogen-dependent proliferation of primordial germ cells in vitro[J].Mol Endocrinol，2003，17：2630-2638.

[6] Yadav RP，Kotaja N.Small RNAs in spermatogenesis[J].Mol Cell Endocrinol，2014，382：498-508.

[7] Porter LA，Dellinger RW，Tynan JA，et al.Human Speedy：a novel cell cycle regulator that enhances proliferation through activation of Cdk2[J].J Cell Biol.2002，157：357-366.

[8] Massart A，Lissens W，Tournaye H，et al.Genetic causes of spermatogenic failure[J].Asian J Androl，2012，14：40-48.

[9] Cheng A，Xiong W，F(xiàn)errell JE Jr，et al.Identification and comparative analysis of multiple mammalian Speedy/Ringo proteins[J].Cell Cycle，2005，4：155-165.

[10] Liu ML，Pei KY，Shi XQ，et al.Identification and characterization of a novel spermatogenesis related gene LM23 in rat testis[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，356：576-581.

[11] Liu ML，Cheng YM，Jia MC.LM23 is essential for spermatogenesis in Rattus norvegicus[J].Front Biosci(Elite Ed)， 2010，2：187-194.

[12] Cheng YM，Liu ML，Jia MC.LM23 is a novel member of the Speedy/Ringo family at the crossroads of life and death of spermatogenic cell[J].Asian J Androl，2011，13：446-452.

[13] Tu Z，Bayazit MB，Liu H，et al.Speedy A-Cdk2 binding mediates initial telomere-nuclear envelope attachment during meiotic prophase I independent of Cdk2 activation[J].Proc Natl Acad Sci USA，2017，114：592-597.

[14] Mikolcevic P，Isoda M，Shibuya H，et al.Essential role of the Cdk2 activator RingoA in meiotic telomere tethering to the nuclear envelope[J].Nat Commun， 2016，7：11084.

[15] Borg CL，Wolski KM，Gibbs GM，et al.Phenotyping male infertility in the mouse：how to get the most out of a ’non-performer’[J].Hum Reprod Update，2010，16：205-224.

[16] Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V，et al.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisensecomplementarity to lin-14[J].Cell，1993，75：843-854.

[17] 石心泉，賈孟春，劉美玲.LM23基因沉默引起大鼠睪丸生精細胞凋亡[J].生殖醫(yī)學雜志，2010，19：337-341.

[18] 成毅明，劉美玲，王介東，等.LM23基因降調(diào)激活Fas-FasL和線粒體通路使精母細胞凋亡[J].生殖醫(yī)學雜志，2011，20：206-210.

[19] Gulino R，F(xiàn)orte S，Parenti R，et al.MicroRNA and pediatric tumors：Future perspectives[J].Acta Histochem，2015，117：339-354.

[20] Donadelli M，Dando I，F(xiàn)iorini C，et al.Regulation of miRNA-23b expression and its dual role on ROS production and tumour development[J].Cancer Lett，2014，349：107-113.