余海燕， 劉德生， 王 云

(青海省人民醫(yī)院麻醉科， 青海 西寧 810001)

大腸癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，近些年隨著人民膳食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，大腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，對(duì)人們的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅，主要治療手段為外科手術(shù)，但相當(dāng)多的患者就診時(shí)已處于晚期，錯(cuò)失了最佳的治療時(shí)機(jī)，造成術(shù)后的復(fù)發(fā)率高，且5年生存率低[1-2]。因此，尋找新的治療方法具有重要意義。腫瘤手術(shù)中麻醉是不可或缺的部分，麻醉過(guò)程中使用的藥物可能對(duì)腫瘤有有害或有益的作用，從而影響腫瘤的預(yù)后及治療。丙泊酚(propofol)是常用的一種靜脈麻醉藥物，廣泛用于麻醉維持、麻醉誘導(dǎo)及重癥監(jiān)護(hù)室[3]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[4-5]，若在手術(shù)治療過(guò)程中，采用丙泊酚麻醉患者，可能具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和促凋亡作用。目前，關(guān)于丙泊酚對(duì)結(jié)直腸癌的影響機(jī)制尚不清楚。本研究擬在離體條件下，探討丙泊酚對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力、侵襲和凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞、主要試劑和儀器

大腸癌LoVo細(xì)胞株購(gòu)自濟(jì)南賽爾生物科技有限公司。

丙泊酚購(gòu)自AstraZeneca；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco；Transwell小室購(gòu)自Millipore；CCK-8試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒和膜聯(lián)蛋白 V(Annexin V)-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、活化的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)、Notch1和發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(hairy and enhancer of split 1，Hes1)抗體均購(gòu)自Abcam。酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad；流式細(xì)胞儀購(gòu)自Becton Dickinson。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) LoVo細(xì)胞在37 ℃、5% CO2、95%飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中，用含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的 LoVo細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×107/L密度每孔加入200 μL接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為丙泊酚組和對(duì)照組。丙泊酚組分別加入10、25、50和100 μmol/L的丙泊酚處理細(xì)胞72 h，或用100 μmol/L的丙泊酚處理細(xì)胞12、24、48和72 h；對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立調(diào)零孔。各組細(xì)胞作用至規(guī)定時(shí)點(diǎn)后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用空白對(duì)照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞A值/對(duì)照組細(xì)胞A值×100%。

2.3Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 4 ℃融化Matrigel，于冰上將Matrigel用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)按照1∶6稀釋，取35 μL鋪在小室內(nèi)，常溫放置10～15 min風(fēng)干，Transwell小室的上室中加入200 μL的丙泊酚(100 μmol/L)處理72 h的細(xì)胞懸液(密度為1×108/L)，下室中加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)，膜清洗，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，顯微鏡下拍照，隨機(jī)取6個(gè)不同的視野(×200)觀察并記錄穿膜的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算每組小室細(xì)胞的平均數(shù)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 以2×108/L的密度將 LoVo細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，100 μmol/L的丙泊酚處理細(xì)胞72 h，離心收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌后迅速用預(yù)冷的70%乙醇固定，-20 ℃過(guò)夜后，離心去除乙醇，預(yù)冷的PBS洗滌，碘化丙錠(propidium iodide，PI)避光染色20 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的周期分布。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 以2×108/L的密度將 LoVo細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL， 100 μmol/L的丙泊酚處理細(xì)胞72 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記試劑盒用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

2.6Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 取100 μmol/L的丙泊酚處理72 h的細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液于冰上充分裂解，離心，收集上清，取少量蛋白用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。每泳道30μg的上樣量經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入抗MMP-2、MMP-9、cleaved caspase-3、Notch1、Hes1(均按1∶500稀釋)和GAPDH(1∶1 000稀釋) I 抗，4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光后，X線顯像。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1丙泊酚抑制LoVo細(xì)胞的活力

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0、10、25、50和100 μmol/L的丙泊酚處理LoVo細(xì)胞72 h后，細(xì)胞活力分別為(100.00±4.44)%、(96.88±4.12)%、(91.79±4.39)%、(80.22±3.44)%和(62.48±3.54)%，細(xì)胞活力隨劑量的增加而減少，50和100 μmol/L的丙泊酚可顯著抑制細(xì)胞的活力(P<0.01)，見(jiàn)圖1A；100 μmol/L的丙泊酚處理細(xì)胞0、12、24、48和72 h后，細(xì)胞活力分別為(100.00±5.12)%、(95.31±5.02)%、(85.12±4.75)%、(71.18±4.22)%和(60.09±3.78)%，細(xì)胞活力可隨著時(shí)間的延長(zhǎng)降低，從24 h起可顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.01)，見(jiàn)圖1B。

Figure 1. The effect of propofol on the viability of the LoVo cells. A: the viability of the LoVo cells treated with propofol at different doses; B: the viability of LoVo cells treated with propofol at different time. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group；##P<0.01vs0 h group.

圖1丙泊酚對(duì)LoVo細(xì)胞活力的影響

2丙泊酚抑制LoVo細(xì)胞的侵襲能力

Transwell小室檢測(cè)100 μmol/L的丙泊酚處理LoVo細(xì)胞72 h后細(xì)胞侵襲能力的變化，并以Wes-tern blot檢測(cè)侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，丙泊酚組相對(duì)侵襲細(xì)胞明顯減少(P<0.01)，細(xì)胞侵襲能力及MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

3丙泊酚阻滯LoVo細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的周期變化，結(jié)果顯示，丙泊酚組G0/G1期細(xì)胞顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，S期細(xì)胞顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 2. The effect of propofol on the invasion ability of LoVo cells. A: the results of Transwell assay (crystal violet staining，×100); B: the protein expression of MMP-2 and MMP-9 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2丙泊酚對(duì)LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 3. The effect of propofol on the cell cycle distribution of the LoVo cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3丙泊酚對(duì)LoVo細(xì)胞周期分布的影響

4丙泊酚促進(jìn)LoVo細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LoVo細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，對(duì)照組和丙泊酚組細(xì)胞凋亡率分別為(5.18±0.67)%和(19.63±1.22)%，丙泊酚組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

5丙泊酚對(duì)LoVo細(xì)胞cleavedcaspase-3、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3及Notch1信號(hào)通路相關(guān)蛋白Notch1和Hes1的蛋白水平，結(jié)果顯示，丙泊酚組cleaved caspase-3的蛋白水平顯著高于對(duì)照組，而Notch1和Hes1的蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

討 論

近年來(lái)的研究顯示，一些麻醉藥物除了有鎮(zhèn)靜作用外，還能抗腫瘤和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，其中最典型的是丙泊酚。丙泊酚的有效成分為2,6-二異丙酚，是臨床上常用的靜脈麻醉藥，在各種手術(shù)的麻醉誘導(dǎo)中廣泛使用，其特有的結(jié)構(gòu)能抑制炎癥細(xì)胞聚集、增殖、活化及減少釋放炎癥因子，從而達(dá)到抗炎作用[6-7]。新近的研究顯示，丙泊酚可通過(guò)直接或間接作用抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和生存能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到有效的抗腫瘤作用[8-10]。有報(bào)道顯示，丙泊酚可抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲[11]；通過(guò)下調(diào)ERK-VEGF/MMP-9信號(hào)通路抑制食管癌細(xì)胞的增殖[12]；通過(guò)調(diào)控miR-9/NF-κB信號(hào)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲[13]；通過(guò)激活GABA-A受體使MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)[14]。以上的研究說(shuō)明丙泊酚可通過(guò)不同作用途徑抑制不同腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等過(guò)程。本研究以大腸癌細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)了丙泊酚對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響，結(jié)果顯示，丙泊酚可顯著抑制大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，阻滯細(xì)胞周期，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。侵襲是惡性腫瘤的標(biāo)志之一，受到多種基因和蛋白的調(diào)控及其它多種因素的影響。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)可使細(xì)胞外的基質(zhì)及基膜中的大多數(shù)蛋白質(zhì)降解，正常情況下在組織中以平衡狀態(tài)存在，而在腫瘤中平衡被打破，表達(dá)增強(qiáng)，降解細(xì)胞外的基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力[15-16]。食管癌和肝癌等腫瘤中MMP基因的表達(dá)升高與腫瘤預(yù)后及轉(zhuǎn)移相關(guān)[17-18]。MMP-2和MMP-9在MMPs家族中被研究得較多。有研究指出，大腸癌中MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著升高，其表達(dá)與大腸癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制其表達(dá)可顯著降低大腸癌細(xì)胞的侵襲能力[19-20]。細(xì)胞的增殖和凋亡不平衡是引起腫瘤發(fā)生的原因，caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究中已檢測(cè)丙泊酚可促進(jìn)結(jié)直腸細(xì)胞的凋亡，是否是通過(guò)調(diào)控caspase家族引起的凋亡還未可知。Caspase-3的基因定位于人染色體4q32～35.1，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵酶，也是caspase家族最重要的凋亡執(zhí)行者之一，在受到凋亡信號(hào)刺激后被激活，降解多種蛋白底物，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，作為凋亡過(guò)程中的效應(yīng)蛋白，是多種凋亡刺激信號(hào)的匯聚點(diǎn)，其活性將使凋亡進(jìn)入不可逆階段[21-23]。本研究的結(jié)果說(shuō)明，丙泊酚可通過(guò)下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)而抑制細(xì)胞侵襲，上調(diào)cleaved caspase-3而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Figure 4. The effect of propofol on the apoptosis of LoVo cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4丙泊酚對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. The effect of propofol on the protein levels of cleaved caspase-3, Notch1 and Hes1 in the LoVo cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5丙泊酚對(duì)LoVo細(xì)胞cleavedcaspase-3、Notch1和Hes1蛋白水平的影響

Notch信號(hào)通路由Notch受體、配體及DNA結(jié)合蛋白組成，在進(jìn)化上高度保守，不僅影響正常細(xì)胞的增殖、發(fā)育、凋亡和分化，而且影響多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)展[24-25]。Notch1是Notch信號(hào)通路的一個(gè)受體，在人類T淋巴母細(xì)胞白血病中被鑒定出來(lái)，與腫瘤的發(fā)生存在密切關(guān)系，在多種腫瘤細(xì)胞中有異常表達(dá)，如大腸癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤等，該信號(hào)的紊亂可通過(guò)直接或間接作用引起腫瘤的發(fā)生[26-28]。有研究指出，抑制Notch1可降低肝癌和膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)展[29-30]。Hes1是Notch1信號(hào)的關(guān)鍵靶基因，是Notch1信號(hào)是否激活的標(biāo)志[31]。本研究檢測(cè)丙泊酚對(duì)Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，Notch1和Hes1蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。這說(shuō)明丙泊酚可通過(guò)下凋Notch1信號(hào)通路降低大腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，丙泊酚可通過(guò)下調(diào)Notch1信號(hào)通路降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，阻滯細(xì)胞周期，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，提示丙泊酚可能作為腫瘤治療手術(shù)中理想的麻醉藥。但本研究只在細(xì)胞水平檢測(cè)丙泊酚的作用，后期將做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以更深入研究丙泊酚在結(jié)直腸癌中的作用。

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