劉邦儉， 王 琦， 于德新△， 趙 韌

(1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科， 安徽 合肥 230601； 2太和縣第二人民醫(yī)院泌尿外科， 安徽 太和 236600； 3安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 安徽 合肥 230022)

膀胱癌是一種泌尿系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率在尿路上皮腫瘤中超過(guò)95%[1]。手術(shù)治療及化學(xué)藥物灌注等常見(jiàn)的治療手段雖然取得了一定的效果，但膀胱癌患者中仍然有高達(dá)30%左右的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)[2-3]?；虬邢蛑委熓悄壳爸委熌[瘤的一種重要技術(shù)手段，具有針對(duì)性強(qiáng)和副作用小等優(yōu)點(diǎn)，尋找有效的靶基因治療膀胱癌是目前的研究重點(diǎn)。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，屬于連接蛋白和轉(zhuǎn)錄共啟動(dòng)因子，參與腫瘤的發(fā)生過(guò)程[4-6]。有研究表明，YAP在食管鱗癌、前列腺癌、胃癌、肺癌和肝癌等組織中表達(dá)升高，敲低YAP表達(dá)后的前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌和胃癌等多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞凋亡增加[7-10]。也有研究表明，YAP在膀胱癌中表達(dá)升高[11]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤組織中過(guò)度激活，用Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535抑制其激活后能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。本研究以膀胱癌細(xì)胞為研究對(duì)象，探討YAP對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響，以期為治療膀胱癌提供新思路。

材 料 和 方 法

1材料

膀胱癌細(xì)胞T-24購(gòu)自安徽生物細(xì)胞中心。Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen；小干擾RNA陰性對(duì)照(small interfering RNA negative control，siRNA-NC)和YAP小干擾RNA(YAPsiRNA)購(gòu)自上海愛(ài)丁堡生物科技發(fā)展有限公司；YAP和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于天根生化科技(北京)有限公司；Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535購(gòu)自Sigma；抗β-catenin單克隆抗體、抗c-Myc單克隆抗體和抗YAP單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 膀胱癌細(xì)胞T-24分為正常對(duì)照(control)組、siRNA-NC組和YAPsiRNA組，siRNA-NC組和YAPsiRNA組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC和YAPsiRNA，control組為不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將膀胱癌細(xì)胞T-24接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(接種密度為1×109/L)，觀察細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，依照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

2.2Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中YAP的mRNA表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入1 mL Trizol(每106個(gè)細(xì)胞加1 mL)，裂解反應(yīng)10 min，加1 mL的三氯甲烷溶液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取400 μL的上層水相層溶液與等體積的異丙醇混合后，靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清，用75%的乙醇溶液洗滌2次后，在室溫下自然晾干，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA的濃度及純度。Real-time PCR檢測(cè)YAP表達(dá)，程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。YAP的上游引物序列為5’-ACCACAGCTCAGCATCTTCG-3’，下游引物序列為5’-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列為5’-GGAGTGTTGGAGAAGTCATATAC-3’。以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計(jì)算YAP的mRNA表達(dá)水平。

2.3Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中YAP的蛋白表達(dá)水平 Control組、siRNA-NC組和YAPsiRNA組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min后，14 000 r/min，4 ℃離心20 min，將蛋白上清轉(zhuǎn)移到EP管中。用BCA法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量，步驟參照BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒。將蛋白樣品與等量的2×Loading Buffer混合煮沸5 min。10%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行凝膠電泳，每孔上樣量為50 μL。在濃縮膠中用90 V電壓電泳，在分離膠中用120 V電壓電泳。4 ℃將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，依次與 I 抗(800倍稀釋，4 ℃過(guò)夜)和 II 抗(1 000倍稀釋，室溫1 h)孵育后，顯色，以GAPDH為內(nèi)參照，分析YAP的蛋白水平。

2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 Control組、siRNA-NC組和YAP siRNA組以每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞懸浮液體積為100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組7個(gè)復(fù)孔，以不加細(xì)胞的孔調(diào)零。48 h后在每孔中加入20 μL MTT (5 g/L)溶液，37 ℃孵育4 h，吸除上清液，加入150 μL的二甲基亞砜，反應(yīng)10 min后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm每孔的吸光度(A)。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Control組、siRNA-NC組和YAPsiRNA組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用胰蛋白酶消化，離心后，加入適量預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)，使細(xì)胞濃度為1×109/L。收集1 mL的細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入結(jié)合緩沖液，依次加入5 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)和膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC，避光反應(yīng)25 min，加入400 μL的結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.6Western blot法檢測(cè)β-catenin和c-Myc的蛋白表達(dá) Control組、siRNA-NC組和YAPsiRNA組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞蛋白，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin和c-Myc表達(dá)水平，步驟參照2.3。

2.7Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535對(duì)細(xì)胞活力及凋亡的影響 將轉(zhuǎn)染YAPsiRNA后的膀胱癌細(xì)胞T-24用20 μmol/L的Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535作用48 h，記為YAPsiRNA+FH535組，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)β-catenin和c-Myc的蛋白表達(dá)水平，步驟參照2.4、2.5和2.6。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中YAP表達(dá)水平的變化

Real-time PCR結(jié)果顯示，YAPsiRNA組的YAP mRNA水平和蛋白水平均明顯低于control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The expression of YAP at mRNA (A) and protein (B) levels in transfected T-24 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中YAP表達(dá)水平

2YAP對(duì)細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，YAPsiRNA組的細(xì)胞活力明顯低于control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The effect of YAP on the viability of transfected T-24 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2YAP對(duì)細(xì)胞活力的影響

3YAP對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，YAPsiRNA組的細(xì)胞凋亡率明顯高于control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4YAP對(duì)細(xì)胞中β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，YAPsiRNA組的β-catenin和c-Myc明顯低于control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

5Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535對(duì)細(xì)胞活力的影響

如圖5所示，YAPsiRNA+FH535組細(xì)胞中的c-Myc和β-catenin的水平均低于YAPsiRNA組；YAPsiRNA+FH535組細(xì)胞活力也明顯低于YAPsiRNA組(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

6Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，YAPsiRNA+FH535組的細(xì)胞凋亡率明顯高于YAPsiRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

討 論

YAP基因編碼一個(gè)65 kD的含有脯氨酸的蛋白分子，該蛋白含有2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域(這種結(jié)構(gòu)域包含35～40個(gè)氨基酸)，是Hippo信號(hào)通路的核心蛋白[13]。Liu等[14]通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)了宮頸癌組織和正常宮頸組織中YAP的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YAP在宮頸癌組織中的表達(dá)水平升高，并且與宮頸癌的臨床分期有關(guān)。張寧南等[15]收集了膀胱癌及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中YAP mRNA和蛋白水平均明顯高于癌旁組織，而通過(guò)siRNA干擾T40細(xì)胞中YAP的表達(dá)之后，T40細(xì)胞S期細(xì)胞比例下調(diào)，細(xì)胞遷移能力下降。本研究結(jié)果顯示，干擾YAP表達(dá)后的膀胱癌細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡增多。這與之前的研究報(bào)道相符，均表明干擾YAP能夠發(fā)揮抑制癌癥發(fā)展的作用。

Figure 3. The effect of YAP on the apoptosis of transfected T-24 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3YAP對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. The effect of YAP on the protein expression of β-catenin and c-Myc in transfected T-24 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4YAP對(duì)細(xì)胞中β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)的影響

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在機(jī)體肺臟和肝臟等組織器官的細(xì)胞中廣泛存在，不僅參與細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程，還參與心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和腦血管等疾病的發(fā)生[16]。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，而c-myc是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因[17]。近年來(lái)的研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤組織中過(guò)度活化[18]。Chen等[19]檢測(cè)了不同宮頸癌組織中β-catenin的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin在宮頸癌組織中的表達(dá)水平升高，并且在HeLa、SiHa和CaSki細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常的相對(duì)表達(dá)量。Pierzynski等[20]運(yùn)用免疫組化的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路的啟動(dòng)子在膀胱癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為71%，而在正常的癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率為30%。萬(wàn)雪蓮等[21]發(fā)現(xiàn)激活膀胱癌細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路能夠逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule，HepaCAM)對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制作用。這些結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與多種膀胱癌細(xì)胞的多種生物學(xué)特性調(diào)控生長(zhǎng)過(guò)程，該信號(hào)通路的活性高低直接影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。

Figure 5. The viability of transfected T-24 cells exposed to the Wnt/β-catenin signaling pathway inhibitor FH535. A: the result of Western blot for detecting the protein expression levels of β-catenin and c-Myc; B: the cell viability after exposure to FH535 measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsYAPsiRNA group.

圖5Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535作用后細(xì)胞活力的變化

Figure 6. The changes of apoptosis of transfected T-24 cells after exposed to the Wnt/β-catenin signaling pathway inhi-bitor FH535. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsYAPsiRNA group.

圖6Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535作用后細(xì)胞凋亡情況

YAP是Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，也是Hippo信號(hào)通路下游核心轉(zhuǎn)錄激活因子，其激活后可以調(diào)控與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤進(jìn)一步發(fā)生[22]。而Wnt信號(hào)通路也是通過(guò)作用于β-catenin，使β-catenin進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)與TCF/LEF結(jié)合，從而激活下游與細(xì)胞增殖相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[23]。在遺傳學(xué)上，Hippo通路與Wnt通路可以相互作用，而其具體的作用機(jī)制尚不清楚[24]。YAP基因含有一個(gè)TEAD結(jié)合區(qū)，該區(qū)域可以同β-catenin的N端特異性結(jié)合，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞漿內(nèi)聚集，抑制Wnt通路的激活；另外，YAP基因還可以與Dvl相結(jié)合，抑制β-catenin的核定位，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路功能受阻[25-26]。還有研究報(bào)道稱，β-catenin也可以同YAP的啟動(dòng)子相結(jié)合，調(diào)控YAP蛋白的表達(dá)[27]。

本研究結(jié)果顯示，干擾YAP表達(dá)后膀胱癌細(xì)胞中β-catenin和c-Myc表達(dá)水平下降，而進(jìn)一步抑制Wnt信號(hào)通路的激活能夠協(xié)同干擾YAP對(duì)膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡促進(jìn)作用。這提示，干擾YAP表達(dá)能夠通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的凋亡，并抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討YAP在膀胱癌發(fā)病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)，為靶向YAP治療膀胱癌提供理論基礎(chǔ)。

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