蔣培基，王德良，江偉，宋濤，李濤，蒲彪，欒春光*

1(四川農業(yè)大學 食品學院，四川 雅安，625014) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

啤酒花，?？撇輰俣嗄晟试荼局参?，雌雄異株，是除大麥之外啤酒釀造的主要原料之一，被稱之為“啤酒之魂”、“綠色黃金”[1]。其主要功能成分是酒花樹脂、酒花油和多酚物質。這些物質賦予啤酒以特有的苦味與香味[2]。此外，酒花樹脂還具有防腐的能力，可以延長啤酒的保質期，而多酚物質中的單寧則具有澄清麥汁的作用[3]。

2014年，全球的酒花產量在96 000 t左右[4]，其中國產啤酒花產量達到了12 500 t，占到了13%[5]。我國的啤酒花主要分布在甘肅、新疆兩省，甘肅種植面積最大，且甘肅省河西走廊的暖溫帶干旱氣候有助于優(yōu)良啤酒花的培育。啤酒花的品種以及添加工藝的不同會使啤酒形成不同的苦味與風味特征[6]，例如Chinook和Cascade酒花能夠賦予啤酒樹脂和柑橘類水果風味[7]。此外，啤酒花品種對啤酒的質量也會產生影響，聶聰[8]等人的研究表明，香型酒花的品種是決定啤酒香味質量的關鍵，在釀造過程中應多用苦香兼優(yōu)型、香型和免煮沸酒花制品。

盡管人們已經認識到酒花品種對啤酒質量起著重要作用，但一直以來，酒花的品種鑒定是一個難題。這主要是因為啤酒花品種鑒別通常使用傳統(tǒng)方法，即從形態(tài)上加以區(qū)別，包括啤酒花的顏色、形態(tài)及主要成分[9]。但由于市場需求和工藝的改進，供應商提供的酒花都是經過粉碎后制成的顆粒酒花制品，無法使用傳統(tǒng)的方法加以鑒別。為此分子水平的鑒定方法，例如種子貯藏蛋白或同工酶電泳等經典的物種鑒定方法被開發(fā)出來。但以上方法無法滿足物種鑒定所需的效率和精確度[10]。而基于第一、二代DNA分子標記技術建立起來的鑒定方法，比如限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphism,RFLP)、隨機擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)[11-13]和微衛(wèi)星標記(simple sequence repeats,SSRS)[11,14-15]雖然相對于蛋白水平的鑒定具有一定優(yōu)勢，但這些方法都是基于核酸片段的多少和片段大小來完成物種的鑒別，因此對于親緣關系相近的兩個品種存在判斷上的誤差，且無法完成混雜或人為摻雜的樣品進行檢測。

作為第3代DNA分子標記技術的SNP(單核苷酸多態(tài)性)的出現(xiàn)為酒花品種的定性和定量鑒定提供了更為可靠的手段。有研究表明，SNP將會是一種高效、準確的品種鑒定工具。PITRA[16]對178個酒花品種進行基因測序，分析后共獲得了17 128個SNP位點。HENNING[17]等對121個酒花品種進行測序后得到了1 006個SNP位點，最終確定了7個可以區(qū)分121個酒花品種的SNP位點。YAMAUCHI[18]通過對酒花品種轉錄組進行分析，最終得到能分開16個酒花品種的SNP組合。以上研究雖然在尋找可用于酒花品種鑒定的SNP組合的工作上取得了一些進步，但并沒有建立一套系統(tǒng)的、可靠的酒花品種鑒定方法。而且，以上研究中存在SNP真實性驗證的可靠性低、樣品代表性差以及無法對混合樣品定性定量測試等缺點。針對以上問題，本研究提出了一種利用最新的SNP分子標記技術與KASP基因分型檢測技術相結合[19]，對混合的商業(yè)啤酒花顆粒進行純度檢測的技術。該技術可以滿足啤酒企業(yè)對原料的質量監(jiān)測的要求，同時可為啤酒企業(yè)對原料質量的把控提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬可波羅、Saaz、Tradition、Magnum、Aurora、Galenq、Centinnia啤酒花樣品由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院收集。預混樣品是由Tradition啤酒花與Magnum啤酒花按照不同的質量百分比進行混合，混合比例為0%、2%、5%、10%、20%、40%、50%、100%，并標記為T1～T8。某啤酒廠送檢的2份不同批次的Saaz商業(yè)啤酒花樣品，標記為樣品A與樣品B。

Taq酶、dNTP、10×loading buffer購自大連寶生物技術有限公司；PCR引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成；KASP引物，上海艾吉析科技有限公司；Qiagen DNeasy Plant Mini Kit(50)植物基因組高效提取試劑盒購自德國凱杰生物公司。

1.2 儀器與設備

Veriti 96 Well Thermal Cycler、Qubit 3.0，北京Thermo Fisher Scientific有限公司；ABI7500實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 啤酒花基因組的提取

稱取啤酒花樣品20 mg，加液氮研磨。研磨后的樣品轉移至2 mL effendorf管中，按QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit(50)DNA提取試劑盒步驟提取啤酒花基因組DNA。利用0.8%瓊脂糖TAE凝膠電泳和Nanodrop核酸檢測儀對提取到的酒花樣品基因組進行檢測。

1.3.2 SNP位點的篩選

從DDBJ數據庫(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)上查找并下載啤酒花基因組信息(登錄號：PRJDB3233)。同時，結合本研究測序的7個酒花樣品基因組信息(本實驗室前期研究結果，未發(fā)表)完成SNP位點的篩選。然后，使用premier 5.0軟件在SNP位點前后200 bp處設計引物，用來擴增對應帶有SNP位點的DNA片段，引物由北京生工生物公司合成。PCR反應體系為25 μL：包括10×loading buffer 2.5 μL；dNTP 2 μL；上游引物 1 μL；下游引物 1 μL；基因組DNA 1 μL；Taq酶 0.2 μL；ddH2O 17.3 μL。 PCR反應條件：95 ℃ 5 min ；95 ℃變性30 s, 52～60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35個循環(huán)；72 ℃，7 min。擴增產物使用0.8%瓊脂糖TAE凝膠電泳檢測。PCR擴增產物的測序由北京生工生物完成，測序結果使用MegAlign軟件進行比對。篩選并統(tǒng)計多態(tài)性良好的SNP位點信息，以及7個啤酒花品種在位點上的基因型，用來建立區(qū)分圖。

1.3.3 預混樣品的檢測

根據篩選出來的SNP位點信息合成KASP引物。同時，提取T1～T8預混樣品的基因組DNA作為反應模板，使用篩選得到的8個SNP位點的KASP引物在ABI7500實時定量PCR儀器上進行檢測。反應體系為：DNA 1 μL ,2×master mix 5 μL, 雙蒸水 4 μL, primer mix 0.14 μL。KASP反應條件按照使用說明進行設置，反應條件的設置以及結果的讀取均在7500 Software v2.3.軟件上進行。

1.3.4 實際樣品的真實性檢測

分別稱取5 g的樣品A與樣品B，加液氮在研缽中充分研磨，分別將100 mg樣品轉移至2mL EP管中?；蚪M的提取參照1.3.1提取方法進行并檢測。此過程重復3次。樣品分別標記為A1、A2、A3與B1、B2、B3。根據路線區(qū)分圖選擇合適的SNP位點。利用相應的KASP引物在ABI7500Real-time PCR儀器上進行檢測。檢測的條件以及結果的讀取均參照1.3.3進行。

1.3.5 實際樣品的純度檢測

本研究采用固定初始質量比的方法對預混樣進行定量分析。根據真實性檢測結果，選取具有多態(tài)性檢測結果的SNP位點，以該位點2種不同基因的啤酒花標品DNA按照100%、95%、90%、80%、60%、40%、0%比例混合作為固定比例標準曲線。以提取的實際樣品基因組DNA為模板，用具有多態(tài)性的SNP位點對應的KASP引物在ABI7500 Real-time PCR儀器上進行檢測，檢測的條件以及結果的讀取均參照1.3.3進行,結果重復讀取3次。統(tǒng)計結果中2種不同基因型的熒光信號值，通過SPSS軟件建立多元回歸方程，計算樣品純度。

2 結果與分析

2.1 啤酒花DNA的提取

研究中提取的啤酒花基因組經0.8%瓊脂糖TAE凝膠電泳檢測后，條帶完整，沒有降解。且條帶大小處于所需目的片段范圍之內。經Qubit3.0定量檢測后，DNA質量濃度均大于120 ng/μL，完全符合實驗所需的DNA濃度要求。

2.2 SNP位點的篩選

根據啤酒花基因組信息和生物信息學分析結果，共篩選出8個多態(tài)性較好的SNP位點。SNP位點所在片段的擴增使用的普通PCR引物見表1。篩選出來的多態(tài)性良好的SNP位點信息如表2所示(其中H07與H08位點位于同一擴增片段)。根據統(tǒng)計的不同啤酒花品種在SNP位點上的基因型，建立了7個啤酒花品種的SNP數據表(表3)，同時建立區(qū)分路線圖(圖1)。

表1 本研究使用的普通PCR引物

表2 本研究所用的SNP標記

表3 研究驗證并使用的啤酒花品種的SNP

2.3 預混樣品的檢測

通過以上8個SNP位點的檢測和篩選(結果見圖2)，8個位點檢測結果都符合預混樣在位點的基因型，其中H03、H04、H06位點在T1～T8號預混樣品檢測過程中表現(xiàn)出良好的分型。從圖2可以看出，2%的預混樣在H03與H04號位點都被系統(tǒng)判定為雜合，在H06位點被系統(tǒng)判定為純合。因此，H06位點無法對2%以下的混合樣品進行正確的判斷。進一步的檢測結果表明，5%的預混樣品在3個SNP位點都被判定為雜合狀態(tài)，說明該方法可以滿足對混雜比例>5%的啤酒花樣品進行檢測的要求。且圖中各比例混雜樣品的檢測結果是呈線性比例關系分布。

圖1 七個品種基于SNP區(qū)分路線圖Fig.1 Seven species differentiate route map based on SNP

圖2 T1～T8樣品在8個 SNP位點檢測結果Fig.2 Results of T1～T8 samples at eight SNP maker

2.4 實際樣品的真實性檢測

根據酒花品種區(qū)分路線圖可知， H05與H02位點可以用來對樣品A與樣品B進行區(qū)分鑒定。樣品A的檢測結果如圖3、圖4所示。結果表明，樣品A基因型檢測結果與Sazz完全符合，表明樣品A為純度很高的Saaz啤酒花，純度大于95%。樣品B的檢測結果如圖5、圖6所示，其中H05的基因型檢測結果與Sazz標準品一致，而H02位點出現(xiàn)了雜合狀態(tài)，表明樣品B是含有一定比例的混雜樣品。

圖3 H05位點樣品A基因型檢測結果Fig.3 The qualitative detection result of Sample A at H05

圖4 H02位點樣品A基因型檢測結果Fig.4 The qualitative detection result of Sample A at H02

圖5 H05位點樣品B基因型檢測結果Fig.5 The qualitative detection result of Sample B at H05

圖6 H02位點樣品B基因型檢測結果Fig.6 The qualitative detection result of Sample B at H02

2.5 實際樣品的純度檢測

根據真實性檢測的結果確認H02位點可以被用于混雜樣品B的純度檢測。同時使用Sazz與Tradition啤酒花標準品按照100%、95%、90%、80%、60%、40%、0%的比例混合作標準曲線，結果如圖7所示。圖7中黑色圈中的樣品為樣品B的檢測結果，可見檢測結果重復性很好。標準曲線的熒光信號值見表4。樣品B的3次重復檢測熒光值見表5。通過表4的熒光值數據建立多元回歸方程，得到一次多項式：Saaz酒花所占比例Y=-0.736+0.464×A+0.669×B(A代表T基因型熒光值，B代表G基因型熒光值)，R值為0.939，模型擬合度高。說明該模型能很好的對檢測樣品的純度進行分析，過原點(陰性對照)做3個重復檢測結果平均值做連線并與固定標準曲線相交，計算出交點的兩種基因型熒光值，帶入Y=-0.736+0.464×A+0.669×B中，得到最終測定結果為42.28%±2.5%。

圖7 H02位點樣品B純度檢測結果Fig.7 The quantitative detection of Hop using H02 SNP marker

表4 H02位點固定曲線兩種基因型熒光信號值

Table 4 Two genotypes fluorescence signal values of fixed proportion curve at H02

基因型熒光值100%95%90%80%60%40%0%T3.71±0.023.04±0.022.76±0.022.32±0.021.50±0.010.90±0.01-0.31±0.01G0.18±0.010.34±0.020.50±0.010.65±0.020.90±0.021.00±0.021.40±0.01

表5 H02位點樣品B檢測結果兩種基因型熒光信號值

3 結論

本研究開發(fā)了一套基于SNP分型技術對商業(yè)啤酒花顆粒進行定性定量檢測的方法，并篩選出8個可以區(qū)分7個啤酒花品種的SNP位點。并利用篩選的8個SNP標記可以準確地對7種商業(yè)啤酒花顆粒進行定性檢測。同時，確定了以固定質量比例的方式對啤酒花顆粒進行定量檢測的方法，并對企業(yè)送檢樣品進行了檢測。結果表明，Sazz酒花樣品A純度大于95%，樣品B純度為42.28%±2.5%。本方法的建立為商業(yè)啤酒花顆粒品種的定性和定量檢測提供了全新的檢測方法。目前，關于啤酒花真實性檢測的報道還很少，且大多數的研究僅限于理論上利用SNP方法分析酒花品種上，還沒有建立一套實際可行的檢測方法。本研究開發(fā)了的檢測方法，既滿足了企業(yè)實際生產檢測的需要，同時也完善了啤酒花品種的SNP數據庫，為釀酒原料的品種鑒定提供了一條全新的思路。

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