王銀，張富新，邵玉宇，王畢妮，張哲源，馮翠嬌

(陜西師范大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，陜西 西安，710119)

羊乳具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，其富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)、維生素以及生物活性物質(zhì)[1]。羊乳可加工成乳粉、酸乳、奶酪等多種乳制品，其中攪拌型酸羊乳以其較好風(fēng)味和保健功能深受消費(fèi)者的喜愛。由于羊乳中αs1-酪蛋白含量較低及季節(jié)性成分的影響[2]，羊乳的凝乳特性較差，在攪拌和運(yùn)輸?shù)倪^程中凝乳脆弱，導(dǎo)致組織狀態(tài)破壞、乳清析出，從而失去商品價(jià)值，為了解決上述問題，人們通常在羊乳中添加果膠、黃原膠等穩(wěn)定劑來改善攪拌型酸乳的黏度和持水性[3]，但這些方法對攪拌型酸羊乳的口感及其風(fēng)味造成一定的影響。近年來，隨著食品生物技術(shù)的發(fā)展，人們利用酶處理技術(shù)來提高食品的加工特性，其中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TG)具有催化蛋白質(zhì)側(cè)鏈上谷氨酰胺殘基與賴氨酸之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的蛋白酶，可改變蛋白質(zhì)水合能力、溶解度、持水性、黏度、彈性等凝膠化性能[4-5]，在乳制品[6]、豆制品[7]、肉制品[8]等加工領(lǐng)域已經(jīng)廣泛應(yīng)用。乳中的蛋白質(zhì)是TG的良好底物[9]，可使乳蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)[10]，提高凝膠特性和質(zhì)量品質(zhì)。然而乳蛋白交聯(lián)程度取決于TG濃度、處理時(shí)間、pH等[11-13]，其中TG濃度是影響乳蛋白交聯(lián)的主要因素[14]。因此本研究應(yīng)用不同濃度的TG處理羊乳后，用其制備攪拌型酸羊乳，研究攪拌型酸羊乳貯存期pH、黏度、持水性、風(fēng)味物質(zhì)、乳酸菌數(shù)的變化，為提高攪拌型酸羊乳的品質(zhì)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳，西北農(nóng)林科技大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場的新鮮混合羊乳(乳蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%)；酸奶發(fā)酵劑，丹尼斯克YO-MIX187(由嗜熱鏈球菌Streptococcusthermophilus和保加利亞乳桿菌Lactobacillusbulgaricus組成)；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG-N，100 u/g)，江蘇一鳴生物科技有限公司；MC和MRS瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；丁二酮，美國Sigma公司；SDS、甘氨酸和Tris，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳槽和PowerPacTMBasic電泳儀，美國Bio-Rad公司；UV-5100紫外分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司；Z 206A離心機(jī)，德國Hermle公司；DV2TLVTJ0黏度計(jì)，美國BROOKFIELD公司；PHSJ-4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ChemiDoc-it 510化學(xué)發(fā)光成像儀，美國UVP公司-lb；GSP-9080MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 TG處理羊乳

新鮮羊乳于90 ℃殺菌5 min后，迅速冷卻到40 ℃，按乳蛋白含量添加TG，使羊乳中TG濃度分別達(dá)到1、2、3 u/g蛋白，在40 ℃下處理2 h后，80 ℃滅酶5 min，冷卻至42 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 攪拌型酸羊乳的制備

取TG處理后的羊乳，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的發(fā)酵劑，42 ℃發(fā)酵至凝乳，冷卻至20 ℃，勻速攪拌2 min之后分裝，并且在4 ℃下貯存，并以不添加TG為對照。

1.3.3 黏度

參考SOLEYMANPUORI[15]的方法，用DV2TLVTJ0黏度計(jì)測定攪拌型酸乳的黏度，轉(zhuǎn)子LV-2主軸(No.62)，取30 mL樣品注入測試容器，將轉(zhuǎn)筒完全浸沒到樣品中，測試溫度4 ℃，轉(zhuǎn)速12 r/min，在第59秒時(shí)記錄數(shù)據(jù)。黏度單位mPa·s。

1.3.4 持水性

參考ERCILI[16]的方法。取10 g攪拌型酸羊乳于離心管中，在3 500g下離心10 min，稱取上清液(m)，用(1)式計(jì)算樣品的持水性。

(1)

1.3.5 pH

使用精密pH計(jì)測定。

1.3.6 乳酸菌菌落數(shù)

參考GB 4789.35 — 2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》方法檢測樣品中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，單位為CFU/mL。

1.3.7 風(fēng)味物質(zhì)

參考李妍[17]的方法，取攪拌型酸羊乳樣品30 mL，加入等體積的16%三氯乙酸溶液于離心管中，充分搖勻后，4 500g離心10 min，將上清液用濾紙過濾后，取澄清的上清液測定乙醛和丁二酮含量，同時(shí)以無菌的鮮羊乳作為對照。

1.3.7.1 乙醛

取處理過的上清液10 mL于錐形瓶中，并加入2.0 mL 1%的NaHSO3溶液，搖勻，室溫下放置1 h后，加入1mL 1%淀粉溶液，先用0.1 mol/L的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴至接近終點(diǎn)，再用0.01 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)淡藍(lán)紫色，并且30 s內(nèi)不褪色。然后再加20 mL 1 mol/L的NaHCO3，混勻至顏色消失，用0.01 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)，記錄最后消耗的標(biāo)準(zhǔn)碘液的體積，同時(shí)按上述方法做空白試驗(yàn)。并用(2)式計(jì)算：

(2)

式中：V1，酸乳上清液滴定所消耗I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2，空白滴定所消耗I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C，1/2 I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；0.022，乙醛化學(xué)反應(yīng)基本單位，g；10，乙醛樣品稱樣量，mL。

1.3.7.2 丁二酮

取2支20 mL試管，各加入10 mL上清液，第1支試管中加入0.5 mL 1%的鄰苯二胺溶液，第2支試管不加做空白對照，搖勻后置于黑暗處30 min。待反應(yīng)完全后第1支試管中加2.0 mL 4.0 mol/L HCl，第2支試管加2.5mL HCl，混勻后以第2支試管作為參比溶液，選用石英比色皿于335 nm的波長下測定吸光度值。實(shí)驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.080 9x+0.063 7，R2=0.998 6，其中y為吸光值，x為丁二酮濃度，然后將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中丁二酮濃度，單位為mg/L。

1.3.8 聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS-PAGE電泳采用LAEMMLI[18]的方法，略作修改。將TG處理的羊乳用去離子水稀釋15倍，用4倍上樣緩沖液混合均勻，置于沸水浴中5 min使蛋白質(zhì)變性后，在1 2000 r/min下離心5 min，上層溶液為上樣液。配制5 mL 13.5%分離膠(2.25 mL 30%丙烯酰胺、1.25 mL pH 8.8 tris-Hcl、50 μL 10% SDS、50 μL 10%APS、5 μL TEMED、1.4 mL dd H2O)和2.5 mL 3.75%的濃縮膠(0.313 mL 30%丙烯酰胺、0.313 mL pH 6.8 tris-Hcl、25 μL 10% SDS、37.5 μL 10%APS、3.75 μL TEMED、1.813 mL dd H2O)。制膠完成后，取上樣液10 μL緩慢加入上樣孔中，開始電泳，先將電壓調(diào)至75 mV，在溴甲酚藍(lán)跑出濃縮膠后將電壓調(diào)至200 mV，直到溴甲酚藍(lán)將要跑出分離膠時(shí)停止電泳。從玻璃板中取出凝膠，用染色液(1 g考馬斯亮藍(lán)R-250、450 mL甲醇、100 mL冰乙酸定容至1 L)在搖床中隔夜染色。染色后，將凝膠用脫色液(100 mL甲醇、100 mL冰乙酸定容至1L)處理4 h，每1 h換1次，脫色過后用ChemiDoc-It圖像處理系統(tǒng)拍照并進(jìn)行分析。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件的ANOVA方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析，以p<0.05為差異顯著。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 TG濃度對攪拌型酸羊乳貯存期pH的影響

不同TG濃度處理羊乳后制備的攪拌型酸羊乳在貯存期pH的變化見圖1。

圖1 TG濃度對攪拌型酸羊乳貯存期pH的影響Fig.1 Effect of TG concentration on the pH value on the stirred goat yogurt during the storage period

由圖1可見，攪拌型酸羊乳在貯存期的pH均呈現(xiàn)降低的趨勢。但不同TG濃度處理的酸乳的pH有明顯差別。與未經(jīng)TG處理的對照組相比，經(jīng)TG處理的攪拌型酸羊乳在貯存期pH顯著增加(p<0.05)，且TG濃度越大，攪拌型酸羊乳的pH越高，說明TG處理有抑制攪拌型酸羊乳貯存期間的產(chǎn)酸能力。羊乳經(jīng)TG處理后在制作酸乳時(shí)，由于TG交聯(lián)乳蛋白作用，使乳中易被乳酸菌利用的小分子肽、氨基酸、蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)導(dǎo)致乳酸菌的產(chǎn)酸能力下降，pH升高[19]。ABDULQADR[20]報(bào)道，TG處理羊乳后，酸羊乳的pH明顯高于未經(jīng)TG處理的對照組；牟英杰[21]也發(fā)現(xiàn)用濃度為0.2 μ/g蛋白的TG處理牛乳后，制備的攪拌型酸牛乳的pH明顯增加，這與本研究的攪拌型酸羊乳結(jié)果一致。

2.2 TG濃度對攪拌型酸羊乳貯存期間黏度的影響

不同TG濃度處理羊乳后制備攪拌型酸羊乳在貯存期的黏度變化見圖2。

圖2 TG濃度對攪拌型酸羊乳貯存期黏度的影響Fig.2 Effect of TG concentration on the viscosity of stirred goat yogurt during the storage period

如圖2所示，在攪拌型酸羊乳貯藏期間，隨著貯存期的延長，攪拌型酸羊乳的黏度逐漸增加。但不同TG濃度對其貯存期間的黏度有較大的影響，隨著TG濃度的增加，攪拌型酸羊乳的黏度逐漸增加(p<0.05)。當(dāng)用TG濃度為2 u/g蛋白時(shí)處理后，在貯存21d時(shí)，攪拌型酸羊乳的黏度與對照組相比，黏度提高53%。表明通過TG處理羊乳制備的攪拌型酸羊乳，有利于提高其貯存期間的黏度，提高酸乳的穩(wěn)定性。關(guān)于TG處理提高酸乳黏度已有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)ARNSWORTH[22]以2 u/g蛋白的TG濃度處理牛乳時(shí)，攪拌型酸牛乳的黏度提高了3.5倍；JAROS[23]報(bào)道稱牛乳中添加TG，由于交聯(lián)作用增強(qiáng)了酸乳中蛋白質(zhì)之間相互作用，導(dǎo)致了攪拌型酸牛乳的黏度顯著增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用TG濃度為2～3 u/g蛋白處理羊乳，可顯著提高攪拌型酸羊乳貯存期間黏度，有利于提高酸乳的穩(wěn)定性。

2.3 TG濃度對攪拌型酸羊乳貯存期間持水性的影響

不同TG濃度處理羊乳制備的攪拌型酸羊乳貯存期的持水性見圖3。

圖3 TG濃度對攪拌型酸羊乳貯存期持水性的影響Fig.3 Effect of TG concentration on water holding capacity of stirred goat yogurt during the storage period

酸乳的持水性反映酸乳凝膠對水分的保持能力，對攪拌型酸乳而言，持水性反映酸乳在貯存期間乳清析出能力，持水性越高，酸乳的乳清析出越少。由圖3可知，在攪拌型酸羊乳貯存期間，酸乳的持水性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中在貯存14 d時(shí)，酸羊乳的持水性最高，貯存14 d后，其持水性均有所降低。在攪拌型酸羊乳貯存期間，TG處理羊乳后制備的攪拌型酸羊乳持水性顯著高于對照組(p<0.05)，且隨著TG濃度的增加，持水性逐漸升高，當(dāng)TG處理濃度為2 u/g蛋白時(shí)，攪拌型酸羊乳在第14天的持水性比對照組提高17%。有關(guān)TG濃度對酸乳持水性的影響的報(bào)道有較大區(qū)別，楊洋[24]研究不同TG濃度對攪拌型酸牛乳持水性的影響，在TG濃度為8 u/g蛋白時(shí)，攪拌型酸牛乳的持水性達(dá)到最大；FARNSWORTH[22]在羊乳中加入濃度為2 u/g蛋白的TG時(shí)，酸羊乳的持水性提高了8%。lORENZEN等人[25]報(bào)道TG處理原料乳催化共價(jià)鍵的生成，縮小酸乳凝膠孔徑，增強(qiáng)酸乳凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的持水性。本研究通過TG處理羊乳，在其濃度為2～3 u/g蛋白時(shí)，制備的攪拌型酸羊乳具有較高的持水性。

2.4 TG濃度對攪拌型酸羊乳風(fēng)味物質(zhì)含量的影響

酸乳的風(fēng)味主要由發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生的乙醛和丁二酮形成[26]，通過不同TG濃度處理羊乳后，制備的攪拌型酸羊乳在貯存期間乙醛丁二酮變化見圖4。

圖4 TG濃度對攪拌型酸羊乳貯存期風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.4 Effect of TG concentration on the flavor substance of stirred goat yogurt during the storage period

由圖4可知，攪拌型酸羊乳在貯藏期間乙醛和丁二酮的含量明顯減少，與對照組相比，經(jīng)TG處理制備的攪拌型酸羊乳的乙醛和丁二酮含量降低(p<0.05)，且隨著TG濃度的增加，乙醛和丁二酮的含量在逐漸降低。在酸羊乳發(fā)酵的過程中，典型的風(fēng)味物質(zhì)由乳酸菌的代謝產(chǎn)生羥基類化合物，尤其是乙醛和丁二酮[27]。OZER[28]采用濃度為0～0.5 g/L的TG處理牛乳后，制備的酸牛乳的乙醛含量與TG濃度呈負(fù)相關(guān)。丁二酮在攪拌型酸乳中的含量較低[29]，MARIA[27]分析了TG處理原料乳過后制備的酸乳的丁二酮含量明顯降低(p<0.05)，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。酸乳的風(fēng)味物質(zhì)主要是在低溫貯存過程中產(chǎn)生的，在低溫貯存期乳酸菌活力減弱，可能對風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生一定影響，同時(shí)TG處理后形成的凝膠也可能對風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。

2.5 TG濃度對攪拌型酸羊乳貯存期乳酸菌的影響

不同TG濃度處理羊乳后，制備的攪拌型酸羊乳中的保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌在貯存期菌落數(shù)的變化情況見圖5。

圖5 TG濃度對攪拌型酸羊乳貯存期乳酸菌的影響Fig.5 Effect of TG concentration on Lactobacillus in stirred goat yogurt during the storage period

由圖5可知，攪拌型酸羊乳在貯存期時(shí)，嗜熱鏈球菌呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在貯存7～14 d時(shí)，嗜熱鏈球菌含量較高，而保加利亞乳桿菌在貯存期變化不大。同時(shí)可以看出，TG處理的攪拌型酸羊乳中嗜熱鏈球菌含量明顯降低(p<0.05)，且隨著TG濃度的增加而降低；而TG的攪拌型酸羊乳中保加利亞乳桿菌變化不大，這表明，TG對攪拌型酸羊乳貯存期間嗜熱鏈球菌有抑制作用，而對保加利亞乳桿菌無明顯影響。OZER[28]報(bào)道，TG處理脫脂牛乳后制作的酸牛乳中的益生菌菌落數(shù)明顯降低，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。NEVE[25]指出TG導(dǎo)致酸乳中乳酸菌含量的減少是由于乳酸菌生長所需的小分子肽和氨基酸被TG的催化作用所結(jié)合，而交聯(lián)的小分子肽和氨基酸就不能被乳酸菌所利用，從而抑制了乳酸菌的生長?？傊?，經(jīng)TG處理制備攪拌型酸羊乳顯然乳酸菌含量有所降低，但其總菌數(shù)仍大于106cfu/mL，表明TG處理羊乳后所制備的攪拌型酸羊乳仍然具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。

2.6 TG濃度對羊乳中蛋白質(zhì)交聯(lián)程度的影響

不同TG濃度處理羊乳后，羊乳中主要6種蛋白質(zhì)相對含量的變化情況見圖6。TG處理羊乳后，在40 ℃下保溫2 h，滅酶后采用SDS-PAGE電泳分離出的羊乳中6種主要蛋白質(zhì)，并且采用ChemiDoc-It軟件分析各個(gè)條帶的像素密度，計(jì)算TG處理后單個(gè)蛋白質(zhì)的像素密度占未經(jīng)TG處理樣品像素密度的百分比即為單個(gè)蛋白質(zhì)的相對含量。

圖6 TG濃度對羊乳中蛋白質(zhì)相對含量的影響Fig.6 Effect of TG concentration on the relative content of protein in goat milk during the storage period

從圖6b分析知，本試驗(yàn)采用的羊乳β-酪蛋白的含量最多，α-酪蛋白的含量較少，κ-酪蛋白的含量最少，這與DOMAGAA[14]報(bào)道羊乳αs1-酪蛋白的含量較少一致。由圖6a可以看出，通過TG處理羊乳后，羊乳中κ-酪蛋白和α-乳白蛋白的相對含量變化較大，當(dāng)TG濃度為2 u/g蛋白時(shí)，κ-酪蛋白和α-乳白蛋白相對含量分別降低55%和56%，而αs1、αs2、β-酪蛋白和β-乳球蛋白相對幾乎無明顯變化。表明TG可有效促使κ-酪蛋白和α-乳白蛋白的交聯(lián)，而對αs1、αs2、β-酪蛋白和β-乳球蛋白無交聯(lián)作用，HSIEH[30]報(bào)道酪蛋白膠束表面的κ-酪蛋白是最容易被TG催化發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。GAUCHE[31]報(bào)道乳清蛋白不易發(fā)生交聯(lián)，但在加熱后，α-乳白蛋白變性，增加了TG催化位點(diǎn)，促使交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，而β-乳球蛋白具有較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)球狀四級結(jié)構(gòu)，不容易發(fā)生交聯(lián)，本研究中TG處理羊乳后可有效提高攪拌型酸羊乳貯存期間的持水性與其交聯(lián)程度有關(guān)。

3 結(jié)論

針對不同濃度的TG處理羊乳后經(jīng)發(fā)酵制得的攪拌型酸羊乳，研究其在貯存期的pH、黏度、持水性、風(fēng)味物質(zhì)、乳酸菌的變化情況以及不同TG濃度處理羊乳后乳中蛋白質(zhì)交聯(lián)程度的變化。結(jié)果表明，TG處理過后制備的攪拌型酸羊乳可顯著抑制貯存期間乳酸菌的產(chǎn)酸能力，抑制酸乳中嗜熱鏈球菌的生長活性，而對保加利亞乳桿菌無明顯影響；同時(shí)TG處理也在一定程度上抑制了酸乳中風(fēng)味物質(zhì)的形成，但TG處理可顯著提高攪拌型酸羊乳貯存期間的黏度和持水性。SDS-PAGE電泳表明，TG處理羊乳后，羊乳中κ-酪蛋白和α-乳白蛋白明顯發(fā)生交聯(lián)，從而提高酸乳的黏度和持水性?？傊?，羊乳經(jīng)TG適當(dāng)處理后，有利于提高攪拌型酸羊乳的品質(zhì)。

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