詹超群，鄧尚貴，霍健聰，修策，金凱楠

(浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山，316000)

目前我國(guó)對(duì)魷魚加工副產(chǎn)物的研究利用已取得豐碩成果，如魷魚皮制取膠原蛋白、內(nèi)臟用于生產(chǎn)活性蛋白肽、魷魚眼提取透明質(zhì)酸等[1-2]，但唯獨(dú)對(duì)魷魚骨的加工利用到目前為止基本處于一片空白。

制曲是釀造高品質(zhì)醬油的關(guān)鍵，曲以大豆為主要培養(yǎng)基原料，含有多種微生物及生物酶，通過(guò)降解培養(yǎng)基中的各種蛋白質(zhì)、碳水化合物，進(jìn)而締造氨基酸、肽和葡萄糖等多種醬油風(fēng)味前體物質(zhì)[3-5]。目前研究多集中于菌種復(fù)配對(duì)醬油制曲及風(fēng)味的影響，及制曲工藝條件研究，而對(duì)醬油曲成分對(duì)醬油制曲風(fēng)味影響的研究成果寥寥無(wú)幾。

魷魚骨是當(dāng)前魷魚加工產(chǎn)業(yè)中尚未得到充分利用的一類加工副產(chǎn)物。前期研究發(fā)現(xiàn)：魷魚骨中含有大量蛋白質(zhì)和豐富的呈味氨基酸，是一類極具開發(fā)潛力的蛋白質(zhì)資源?；谶@一狀況，本研究以魷魚骨為研究對(duì)象，將其添加到制曲原料中，探討其對(duì)醬油曲風(fēng)味的影響。本研究不僅有望為海鮮醬油的釀造提供一種風(fēng)味優(yōu)良的種曲，而且符合當(dāng)前水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物高質(zhì)化利用方向。

1 材料與方法

1.1 材料

魷魚骨粉，魷魚骨由浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司提供，為秘魯魷魚骨，曬干后(水分含量5.24%)采用粉碎機(jī)粉碎至120目篩；醬油種曲購(gòu)自上海佳民釀造食品有限公司，為蛋白酶和淀粉酶活性較高的中科3.951(即滬釀3.042)米曲霉孢子；魯氏酵母為實(shí)驗(yàn)室自備(提前配制成108個(gè)/mL的菌懸液)；其余原料如大豆、面粉等均為市售。

試驗(yàn)用甲醛、鹽酸、福林試劑，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司，分析純；乙腈，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司，色譜純。

1.2 主要設(shè)備及型號(hào)

紫外分光光度計(jì)(U-2800)，日本回立公司；固相微萃取設(shè)備(SUPELCO，57330-U)，美國(guó)Supelco公司；萃取頭(100 μm PDMS，聚二甲基硅氧烷)，上海洽姆儀器科技有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用設(shè)備(安捷倫7890B)，美國(guó)安捷倫公司；其余均為實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 醬油曲制備

參考舟山裕大釀造有限公司醬油曲制備工藝：優(yōu)質(zhì)黃豆1 000 g，加入1.3倍的水，浸泡10 h,100 ℃蒸汽滅菌處理20 min，處理后的黃豆冷水沖淋至40 ℃后瀝干，并拌入300 g面粉，攪拌均勻后加入1.95 g種曲(即原料質(zhì)量的0.15%)和10 mL魯氏酵母菌懸液，同時(shí)分別加入0.5%(A組)、1.3%(B組)和2.0%(C組)的魷魚骨粉(以不加入魷魚骨粉為對(duì)照)。醬油曲制備好后進(jìn)行后期培養(yǎng)，33 ℃培養(yǎng)12 h，然后翻曲1次，24 h后再翻曲1次；而后培養(yǎng)溫度降至28 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后制曲結(jié)束。

1.3.2 醬油曲酵母總數(shù)、孢子數(shù)量及質(zhì)量評(píng)定

孢子及酵母菌數(shù)的測(cè)定分別參考SB/T 10315—1999和GB 4789.15—2010；同時(shí)觀察不同時(shí)間醬油曲的外形色澤品質(zhì)。

1.3.3 相關(guān)酶活力的測(cè)定

蛋白酶活力測(cè)定參照GB/T 23527—2009，即40 ℃下水解酪蛋白每分鐘生成1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)蛋白酶活力單位；α-淀粉酶活力測(cè)定參照CHUTMANOP的方法，酶解條件為40 ℃、pH 7.2，以可溶性淀粉為底物、30 min液化10 mg可溶性淀粉所需的酶量為1個(gè)酶活力單位；糖化酶活力測(cè)定采用國(guó)標(biāo)法GB/T 8276—2006，在40 ℃、pH 4.6條件下，1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位。

1.3.4 固形物含量測(cè)定

固定物含量測(cè)定采用105 ℃烘箱法干燥至衡重，根據(jù)前后重量變化確定固形物含量。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)鑒定

參考馮笑軍[6]的方法，略有變動(dòng)。具體操作為：稱取10 g樣品置于100 mL螺口瓶中，加入24 mL蒸餾水和8 g NaCl，聚四氟乙烯密封后于磁力攪拌器上60 ℃攪拌處理15 min，用DVB/CAR/PDMS(二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷)萃取頭吸附60 min，而后插入氣相色譜進(jìn)樣，解析5 min。色譜柱采用安捷倫毛細(xì)柱，升溫速度2 ℃/min，到90 ℃后保溫5 min；而后升溫速度調(diào)至8 ℃/min，到250 ℃后保溫1 min；載氣為氦氣，流量1.0 mL/min；質(zhì)譜條件為電子能力80 eV，電壓350 V，離子源溫度240 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z50～450。測(cè)定完畢后進(jìn)行定性定量鑒定，其中定量鑒定采用面積歸一化法，定量鑒定參考風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用ANOVA方差分析軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲過(guò)程中種曲孢子及酵母菌數(shù)量的變化

制曲過(guò)程中酵母綜述和孢子數(shù)的變化如圖1和圖2所示。由圖1可知，對(duì)照和各處理組在制曲的4～20 h階段酵母總數(shù)均呈上升趨勢(shì)，在20～36 h階段酵母總數(shù)則呈下降趨勢(shì)，對(duì)照組和各處理組在20 h時(shí)出現(xiàn)最大值；各處理組在制曲過(guò)程中均顯著高于對(duì)照組(p<0.05，除4 h外)。孢子在酵母發(fā)酵后期產(chǎn)生，從圖2可以看出，36 h時(shí)兩組孢子數(shù)均達(dá)到8.5×108以上，在相同制曲時(shí)間下總體來(lái)看同對(duì)照組間除個(gè)別組外無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

圖1 制曲過(guò)程中酵母總數(shù)變化Fig.1 The changes of the total number of yeast in koji-making圖中不同小寫字母標(biāo)識(shí)處理間差異顯著(p<0.05)，下同。

圖2 制曲過(guò)程中孢子總數(shù)變化Fig.2 The changes of the spores in koji-making

2.2 制曲過(guò)程中發(fā)酵曲外形色澤變化

圖3是制曲過(guò)程中不同發(fā)酵時(shí)間種曲的外觀形態(tài)變化。

圖3 制曲過(guò)程中不同發(fā)酵時(shí)間種曲外觀形態(tài)變化(B組)Fig.3 Morphologicalchanges of soy sauce koji during different fermentation time (B group)

從圖3可以看出，發(fā)酵16 h，醬油曲外觀附著白灰色菌絲體，淡黃色孢子數(shù)量很少，外觀僅能看出略微呈黃色，曲料松散，有獨(dú)特的曲香味；到24 h時(shí)，曲料表面菌絲體明顯增多，外觀蓬松，外觀呈較為明顯的黃綠色，無(wú)不良?xì)馕?；?dāng)發(fā)酵時(shí)間為36 h時(shí)，曲料外觀成形度差，呈明顯黃色，曲料蓬松，曲香味明顯，同對(duì)照比香味明顯不同。

2.3 制曲過(guò)程中主要酶系活力的變化

蛋白酶是醬油曲質(zhì)量的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[7]，制曲過(guò)程中米曲霉分泌的蛋白酶可以降解大豆蛋白，產(chǎn)生氨基酸、多肽等多種風(fēng)味物質(zhì)，為醬油的良好風(fēng)味做出重要貢獻(xiàn)。滬釀3.042米曲霉是一種發(fā)酵特性較好的曲霉，發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶。由圖4可知，在制曲28～36 h間，各處理組同對(duì)照之間存在顯著性差異(p<0.05)，表明添加魷魚骨粉對(duì)醬油曲酶活力有一定促進(jìn)效應(yīng)，但各添加劑量間酶活力效應(yīng)不同，其中B和C組間無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活力變化Fig.4 Protease activity changes during fermentation

醬油中的單糖、雙糖及簡(jiǎn)單多糖含量對(duì)于增加醬油的黏稠度、提高醬油的掛杯性以及為美拉德反應(yīng)提供原料至關(guān)重要，決定單糖、雙糖等碳水化合物含量的酶是淀粉酶(α-淀粉酶和糖化酶)[9-11]。從圖5和圖6可以看出，各處理組除24 h外，其余時(shí)間α-淀粉酶和糖化酶活力均高于對(duì)照組，表明添加適量魷魚骨粉對(duì)米曲霉產(chǎn)生淀粉酶的活力有促進(jìn)作用。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中α-淀粉酶活力變化Fig.5 Changes of α-amylase activity during fermentatio

前期研究發(fā)現(xiàn)，魷魚骨蛋白質(zhì)含量較高，含有較多的碳水化合物，尤其是氨基酸含量高達(dá)82.86 g/100g，明顯高于海螵蛸，且魷魚骨的氨基酸評(píng)分最接近FAO/WHO氨基酸標(biāo)準(zhǔn)模式，蛋白質(zhì)質(zhì)量較高。魷魚骨中豐富的碳源和氮源可能是促進(jìn)米曲霉生長(zhǎng)，進(jìn)而合成更多高活性淀粉酶的原因。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中糖化酶活力變化Fig.6 Changes of glucoamylase activity during fermentation

2.4 固形物含量

制曲是給微生物提供碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促使微生物菌體數(shù)量大幅增殖的過(guò)程，隨著微生物數(shù)量的增長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗后變成CO2和水散失，培養(yǎng)基質(zhì)量減輕，因而固形物含量能在一定程度上作為衡量制曲的指標(biāo)[8]。從圖7可以看出，隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的固形物含量均呈上升趨勢(shì)，其中添加了魷魚骨粉的實(shí)驗(yàn)組在相同時(shí)間下固形物含量均低于對(duì)照組，表明各實(shí)驗(yàn)組中的酵母生長(zhǎng)繁殖消耗了大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但不同實(shí)驗(yàn)組間存在差異，其中B和C組在培養(yǎng)至36 h時(shí)固定物含量基本相同(60.8%和60.1%)，無(wú)顯著性差異。

圖7 制曲過(guò)程中固形物含量的變化Fig.7 Changes of solids content during fermentation

2.5 醬油曲中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用GC-MS對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組成曲的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。從揮發(fā)性成分種類上來(lái)看，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組檢出的揮發(fā)性成分基本相同(除C組含有少量甲基吡嗪外)，包括5種醇類、8種酯類、4種酸類、4種醛類、2種酚類及其他成分5種，表明添加魷魚骨對(duì)醬油曲揮發(fā)性香氣物質(zhì)的成分沒(méi)有任何影響；從揮發(fā)性成分的含量上來(lái)看，對(duì)照組中除乙醇、乙酸、苯乙酸、庚醛和苯乙醛含量高于實(shí)驗(yàn)組外，其余成分含量均低于實(shí)驗(yàn)組。總體來(lái)看，B組的揮發(fā)性成分含量達(dá)到36.31%，高于對(duì)照組3.58%，也高于A組和C組，且不同實(shí)驗(yàn)組的揮發(fā)性成分含量也各不相同，同添加量并無(wú)相關(guān)性，其中原因有待進(jìn)一步研究。

表1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的GC-MS分析結(jié)果

注：“—”表示未檢出。

3 結(jié)論

添加適量魷魚骨粉對(duì)米曲霉生長(zhǎng)和相關(guān)酶系分泌無(wú)顯著性影響，其中實(shí)驗(yàn)組的酵母數(shù)量顯著高于對(duì)照組，但孢子數(shù)僅略高于對(duì)照組；魷魚骨添加量為1.3%的醬油曲在培養(yǎng)36h時(shí)，曲料色澤發(fā)黃，香氣明顯，質(zhì)量較好；添加魷魚骨對(duì)醬油曲料中微生物各種酶系的分泌有促進(jìn)效果，其中蛋白酶和淀粉酶活性都顯著高于對(duì)照組；添加魷魚骨對(duì)醬油曲料的揮發(fā)性香氣成分種類沒(méi)有影響，且大部分揮發(fā)性成分含量均有不同程度上升，其中B組的揮發(fā)性成分達(dá)到36.31%，顯著高于對(duì)照組的32.73%，表明添加魷魚骨對(duì)于醬油曲的發(fā)酵和品質(zhì)提升具有促進(jìn)效果。

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