張楠，楊勇，李彬彬，徐曄，李仁杰，張姍

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

四川自然發(fā)酵香腸簡(jiǎn)稱四川香腸或川味香腸，是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品之一，因其麻辣爽口的特點(diǎn)深受消費(fèi)者喜愛。近年來，發(fā)酵食品的食用安全性問題不斷受到關(guān)注，而生物胺是關(guān)注熱點(diǎn)。四川香腸的成熟伴隨著復(fù)雜的微生物變化和蛋白質(zhì)變化，原料肉以及自然環(huán)境中的微生物可能會(huì)產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，導(dǎo)致生物胺的產(chǎn)生。生物胺是由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子量含氮有機(jī)化合物[1]，對(duì)于維持人體正常生理功能有著重要意義。但是，過量的生物胺會(huì)對(duì)人體健康造成危害，如高血壓、頭痛、腹瀉和嘔吐等[2]，其中組胺的毒性最大[3]。

SUN等[4]研究結(jié)果表明，30種市售四川香腸中組胺為最主要的生物胺，且所有樣品中組胺含量超過了100 mg/kg。孫霞等[5]對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵四川香腸加工貯藏過程中生物胺含量變化結(jié)果表明，組胺含量在成熟時(shí)高達(dá)127.90 mg/kg。盧士玲等[6]調(diào)查的42個(gè)傳統(tǒng)中式香腸中，有11.9%的樣品組胺超過規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。PAPAVERGOU等[7]發(fā)現(xiàn)，50個(gè)希臘發(fā)酵干香腸中組胺含量在0～515 mg/kg之間，有28%的樣品組胺含量超過了100 mg/kg。ROSEIRO等[8]發(fā)現(xiàn)，20%的薩拉米香腸中組胺含量超過了100 mg/kg，成熟30 d的香腸中生物胺總量約為2 500 mg/kg。由此可見，控制發(fā)酵香腸中組胺的含量，對(duì)保證發(fā)酵香腸的安全有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外專門針對(duì)發(fā)酵香腸中組胺降解菌篩選的研究還鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以四川省內(nèi)不同地區(qū)的20個(gè)自然發(fā)酵香腸樣品作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)能用做香腸發(fā)酵劑且具有降解組胺能力的菌株進(jìn)行篩選鑒定，為四川香腸的安全生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

20個(gè)自然發(fā)酵香腸樣品均購(gòu)于四川省的4個(gè)不同區(qū)域，分別是川西8個(gè)(成都市3個(gè)、雅安市3個(gè)和資陽(yáng)市2個(gè))、川東4個(gè)(遂寧市2個(gè)、南充市2個(gè))、川北4個(gè)(綿陽(yáng)市2個(gè)和廣元市2個(gè))、川南4個(gè)(宜賓市2個(gè)、攀枝花市2個(gè))。香腸成熟時(shí)間均為30 d，采樣后置于無菌塑料袋中，4℃下貯藏備用。

新鮮豬肉、腸衣、食鹽、白酒、白糖等原輔料均購(gòu)于四川省雅安市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

2株生物胺產(chǎn)生菌大腸桿菌(Escherichiacoli)和奧默柯達(dá)菌(Kodamaeaohmeri)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院肉品加工實(shí)驗(yàn)室從四川香腸中分離得到。

1.2 試劑與儀器

試劑：組胺標(biāo)品、丹磺酰氯：Sigma公司；乙腈、丙酮、甲醇等：色譜純；色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、磷酸吡哆醛、鹽酸二甲基對(duì)苯二銨鹽酸鹽、α-萘酚等：分析純；細(xì)菌總DNA提取試劑盒、PCR相關(guān)試劑：天根公司。

儀器：SW-GJ-IFD型超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)泰安公司；SYQ-DSX-280B型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；BMS602型均質(zhì)機(jī)，德國(guó)BRT公司； LC-2010CHT高效液相色譜儀，日本島津；PCR和凝膠成像儀，Bio-Rad；pHS-3C+酸度計(jì)；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司；游標(biāo)卡尺，恒量公司；牛津杯(內(nèi)徑0.6±0.01 cm，外徑0.8±0.01 cm，高度1.0±0.01 cm)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基制作

產(chǎn)胺上層培養(yǎng)基：溴甲酚紫0.06 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 5.2。產(chǎn)胺下層培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基中加入5 g色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸，0.05 g磷酸吡哆醛，調(diào)pH 5.2。

1.3.2 降生物胺乳酸菌分離純化

參照盧世玲等[6]的方法略做修改。取25 g肉樣于225 mL無菌生理鹽水中均質(zhì)混勻，取1 mL進(jìn)行富集培養(yǎng)并梯度稀釋，取稀釋液200 μL涂布于含8 g/L CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，挑取具有溶鈣圈的菌株于產(chǎn)生物胺顯色培養(yǎng)基上進(jìn)行顯色，每個(gè)適宜稀釋度平行3次。5 min內(nèi)顯紫色的為產(chǎn)胺菌，黃色為不產(chǎn)胺菌，平行顯色2次。將2次均顯黃色菌株于MRS培養(yǎng)基上分離純化3次后于4 ℃斜面保藏備用。

1.3.3 菌株初篩

能用做發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的乳酸菌應(yīng)耐受6% NaCl和150 mg/kg NaNO2，具有產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，不產(chǎn)H2O2、H2S、NH3和黏液等特點(diǎn)。由于蛋白質(zhì)為生物胺的前體物質(zhì)，菌株還需對(duì)蛋白質(zhì)無明顯的分解作用，此外具有氧化酶活性的菌株可以降解生物胺。據(jù)此，進(jìn)行以下篩選實(shí)驗(yàn)[9-10]：耐食鹽試驗(yàn)、耐亞硝酸鹽試驗(yàn)、產(chǎn)黏性試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、H2O2試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、產(chǎn)色素檢測(cè)、精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、石蕊牛乳試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、蛋白質(zhì)降解活性試驗(yàn)和氧化酶活性試驗(yàn)。

1.3.4 菌株復(fù)篩

取初篩菌株分離純化3次，并在MRS液體培養(yǎng)基中活化3次，然后接入含300 μg/mL組胺的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，取1 mL樣品，加入0.1 mol/L的鹽酸1 mL后于-20 ℃冰箱中待測(cè)。取1 mL含300 μg/mL組胺的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1 mL作為空白對(duì)照。樣品平行測(cè)定3次取平均值。

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與柱前衍生

準(zhǔn)確稱取組胺標(biāo)品0.010 0 g，用0.1 mol/L的鹽酸定容至10 mL，分別吸取5、10、20、50、100、200、500、1 000 μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10 mL，各取1 mL依次加入200 μL 2 mol/L NaOH，300 μL飽和NaHCO3和2 mL 10 mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液并混勻，40 ℃暗反應(yīng)45 min后加入100 μL的NH4OH去除殘留的丹磺酰氯，加乙腈定容至5 mL后 0.45 μm濾膜過濾，用于標(biāo)曲繪制。

1.3.4.2 樣品檢測(cè)

待測(cè)樣品衍生步驟同1.3.4.1。

1.3.4.3 色譜條件

色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為乙腈，流速為1 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，采用梯度洗脫程序，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.5 菌種鑒定

1.3.5.1 菌落形態(tài)特征鑒定

菌落形態(tài)：觀察分離得到的菌落形態(tài)(形狀、顏色等)，并記錄結(jié)果。

菌株形態(tài)：將菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)(大小、形狀等)，并記錄結(jié)果。

1.3.5.2 生理生化特征鑒定

將篩選得到的菌株用微量發(fā)酵管進(jìn)行生理生化鑒定，參考乳酸菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[11]，對(duì)菌株生理生化特征進(jìn)行分析。

1.3.5.3 分子生物學(xué)鑒定

將所分離得到的菌株在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，按照天根公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明提取DNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

所選用的引物為通用引物：上游引物為27f，下游引物為1492r。PCR反應(yīng)為25 μL體系：包括1 μL的模板DNA，上游引物和下游引物各1 μL，2×Taq Master MIX 12.5 μL，無菌水9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，30個(gè)循環(huán)(95 ℃變性1 min；55 ℃退火90 s；72 ℃延伸2 min)，最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送成都擎科公司測(cè)序，并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行對(duì)比。

1.3.6 菌株生長(zhǎng)特性

1.3.6.1 菌株生長(zhǎng)能力和產(chǎn)酸能力測(cè)定

將菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，每2 h分別用分光光度計(jì)和pH計(jì)測(cè)定600 nm處吸光值和pH值，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，平行3次取平均值。

1.3.6.2 菌株耐食鹽能力和耐亞硝酸鹽能力測(cè)定

將菌株接種到分別含0、20、40、60、80 g/L NaCl和分別含0、50、100、150、200 mg/kg NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處吸光值，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，平行3次取平均值。

1.3.6.3 菌株在不同溫度和酸度下生長(zhǎng)能力測(cè)定

將菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，分別在10、20、30、40、50 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處吸光值，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，平行3次取平均值。

將菌株接種到pH值為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用分光光度計(jì)600 nm處吸光值，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，平行3次取平均值。

1.3.7 抑菌試驗(yàn)

1.3.7.1 降解菌之間的抑制作用

參考劉冬梅等[12]的方法，以鑒定得到的降解菌兩兩做抑菌試驗(yàn)，步驟如下。指示菌在MRS液體培養(yǎng)基中活化24 h后調(diào)OD值為0.8±0.02，取200 μL培養(yǎng)液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上；受試菌活化24 h后調(diào)OD值為0.8±0.02，取1 mL接種到新的培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h， 95 ℃水浴15 min后8 000g離心10 min，取上清液200 μL接入牛津杯中，4 ℃擴(kuò)散4 h后，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察現(xiàn)象。以空白培養(yǎng)基做對(duì)照，平行4次。

1.3.7.2 組胺降解菌對(duì)產(chǎn)胺菌的抑制作用

以兩兩間無抑制作用的降解菌分別對(duì)產(chǎn)胺菌做抑菌試驗(yàn)；以降解菌按1∶1∶1的比例混合后對(duì)產(chǎn)胺菌做抑菌試驗(yàn)。指示菌和受試菌濃度的調(diào)整同1.3.7.1，以空白培養(yǎng)基做對(duì)照，平行4次。用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈大小。

1.3.8 組胺降解菌對(duì)四川香腸組胺含量的影響

1.3.8.1 香腸制作和樣品采集

參照鞏洋[13]的配方和工藝流程制作香腸。

本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定香腸的工藝參數(shù)：發(fā)酵溫度20 ℃，發(fā)酵相對(duì)濕度75%，發(fā)酵時(shí)間2 d；成熟溫度13 ℃，成熟相對(duì)濕度60%，成熟時(shí)間28 d。以篩選得到的組胺降解菌作為發(fā)酵劑，接種量為107CFU/g，菌株按照1∶1∶1的比例混合加入。

實(shí)驗(yàn)分組：A組為未接種組，B組為接種組。取香腸加工貯藏過程中的9個(gè)工藝點(diǎn)，即0(原料肉)、2、6、10、14、18、22、26、30 d進(jìn)行采樣。

1.3.8.2 組胺含量測(cè)定

取5 g肉加入20 mL 0.1 mol/L的鹽酸勻漿，4 ℃，4 000g離心10 min，沉淀部分如前的方法再提取1次。取2次的上清液用0.1 mol/L的鹽酸定容到50 mL，取1 mL樣液進(jìn)行柱前衍生。衍生步驟同1.3.4.1，測(cè)定方法同1.3.4.3。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 組胺降解菌的篩選

2.1.1 菌株分離純化結(jié)果

溴甲酚紫的pH變色范圍為5.2(黃色)～6.8(紫色)，而生物胺是一種有機(jī)堿，當(dāng)菌株產(chǎn)生生物胺時(shí)會(huì)使培養(yǎng)基的pH值高于6.8而變?yōu)樽仙２捎脝螌悠桨迮囵B(yǎng)雙層平板顯色的方法，從不同地區(qū)的20個(gè)市售四川香腸樣品中一共分離得到能在MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)且具有溶鈣圈，倒入上層培養(yǎng)基顯黃色(不產(chǎn)生物胺)的菌株256株(圖1-b)；分離得到在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，倒入上層培養(yǎng)基顯紫色(產(chǎn)生物胺)的菌株7株(圖1-a、1-c)。

2.1.2 菌株初篩結(jié)果

圖1 培養(yǎng)基顯色結(jié)果Fig.1 Chromogenic result of color medium

由于水分的散失，香腸在成熟時(shí)食鹽和亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)能達(dá)到6%和0.015%左右。因此，能用作發(fā)酵劑的菌株應(yīng)耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的食鹽和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.015%的亞硝酸鹽。黏液能影響香腸的組織狀態(tài)，產(chǎn)氣會(huì)影響香腸結(jié)構(gòu)的致密性，H2S、H2O2和NH3等不良?xì)怏w會(huì)影響香腸的風(fēng)味，色素會(huì)影響香腸的感官。因此，發(fā)酵劑應(yīng)該不產(chǎn)黏液、H2S、H2O2、NH3和色素等。另外，亞硝酸鹽不僅具有發(fā)色作用，還能抑制肉毒梭狀芽孢桿菌，因此菌株還應(yīng)該具有還原硝酸鹽的能力。由于蛋白質(zhì)是生物胺的前體物質(zhì)，發(fā)酵劑最好不具有蛋白質(zhì)降解能力。具有氧化酶活性的菌株可以降解生物胺。

在分離得到的256株菌中，符合發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)且具有氧化酶活性的菌株共17株，編號(hào)分別為2、4、19、25、33、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50，初篩結(jié)果如表2所示。將這17株菌進(jìn)行組胺降解能力的測(cè)定。

表2 菌株初篩結(jié)果

注：+：反應(yīng)為陽(yáng)性；-：反應(yīng)為陰性。

2.1.3 菌株降組胺能力

2.1.3.1 組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

由圖2可知，溶劑峰及雜質(zhì)峰在5 min前洗脫，組胺的保留時(shí)間為15.018 min，保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，峰形對(duì)稱、尖銳，能達(dá)到較好的分離度。根據(jù)峰面積求得組胺濃度的回歸方程為y=22 214x+993.97，決定系數(shù)R2=0.999 1，說明線性良好。

圖2 組胺標(biāo)品高效液相色譜圖Fig.2 The HPLC chromatogram of standard histamine

2.1.3.2 組胺降解率測(cè)定結(jié)果

由圖3可知，17株菌對(duì)組胺都有不同程度的降解能力，其中19號(hào)、41號(hào)、46號(hào)、47號(hào)和48號(hào)菌株的降解率分別為23.07%、17.90%、14.48%、15.47%和26.79%，均高于10%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 菌株的組胺降解率Fig.3 The histamine degradation rate of strains

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

將復(fù)篩得到的組胺降解率較高的菌株接種到MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色。菌株和菌落的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果如表3所示。

表3 菌株形態(tài)和菌落形態(tài)鑒定表

2.2.2 生理生化鑒定結(jié)果

參照《乳酸細(xì)菌分離鑒定及其試驗(yàn)方法》對(duì)復(fù)篩得到的5株菌進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表4所示。初步判定19號(hào)為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，41號(hào)為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，46號(hào)為混淆魏斯氏菌(Weissellaconfusa)，47號(hào)和48號(hào)為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)。

表4 菌株生理生化鑒定結(jié)果

注：+：反應(yīng)為陽(yáng)性；-：反應(yīng)為陰性；/：未檢測(cè)。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

采用試劑盒提取編號(hào)為19、41、46、47和48菌株的DNA，用通用引物對(duì)5株菌的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后得到5條長(zhǎng)約1 500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖4所示。

圖4 16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 The electrophoresis results of 16S rDNA PCR amplification

泳道1為marker DL 2 000，泳道2為19號(hào)菌株的PCR產(chǎn)物，泳道3為41號(hào)菌株的PCR產(chǎn)物，泳道4為46號(hào)菌株的PCR產(chǎn)物，泳道5為47號(hào)菌株的PCR產(chǎn)物，泳道6為48號(hào)菌株的PCR產(chǎn)物。將PCR測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表5所示。

表5 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3 抑菌試驗(yàn)

2.3.1 組胺降解菌之間的抑制作用

牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，19號(hào)、41號(hào)、46號(hào)、47號(hào)和48號(hào)5株菌之間無明顯拮抗作用。由于屎腸球菌可能具有耐藥性，根據(jù)菌株鑒定結(jié)果，選擇19號(hào)、41號(hào)和46號(hào)3株安全的且為食源性的乳酸菌，用于后續(xù)研究。

2.3.2 組胺降解菌對(duì)產(chǎn)胺菌的抑制作用

圖5(a)為混合菌對(duì)大腸桿菌的抑菌圖，圖5(b)為單一菌對(duì)奧默柯達(dá)菌的抑菌圖。抑菌圈測(cè)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19號(hào)、41號(hào)、46號(hào)以及混合菌對(duì)大腸桿菌的抑菌圈大小分別在1.530～1.566、1.360～1.478、1.412～1.470、1.688～1.886 cm范圍內(nèi)，對(duì)奧默柯達(dá)菌的抑菌圈大小分別在1.312～1.354、1.318～1.402、1.210～1.370、1.422～1.464 cm范圍內(nèi)。由表6可知，菌株對(duì)大腸桿菌的抑制作用比奧默柯達(dá)菌強(qiáng)，表明大腸桿菌的敏感性比酵母菌強(qiáng)，這可能是由于細(xì)菌和真菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致對(duì)抑菌物質(zhì)的敏感性不同。許多研究表明，乳酸菌的代謝產(chǎn)物，如乳酸[16]，乳酸鏈球菌肽[17]，有機(jī)酸[18]等均具有抑菌活性，而混合菌種對(duì)產(chǎn)胺菌的抑菌圈大小顯著大于單一菌種對(duì)產(chǎn)胺菌的抑菌圈大小(p<0.05)，可能是因?yàn)椴煌甑陌l(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)對(duì)產(chǎn)胺菌的抑制具有協(xié)同作用，而抑菌物質(zhì)的確定還有待進(jìn)一步研究。

a-混合菌對(duì)大腸桿菌的抑菌圖；b-單一菌對(duì)奧默柯達(dá)菌的抑菌圖圖5 組胺降解菌對(duì)組胺產(chǎn)生菌的抑制作用Fig.5 The inhibition of histamine reducing strains to histamine producing strains

表6 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 6 The results of inhibition

受試菌抑菌圈直徑/cm大腸桿菌奧默柯達(dá)菌空白0.805±0.0040.802±0.00319號(hào)1.546±0.0151.334±0.01741號(hào)1.422±0.0491.368±0.03746號(hào)1.444±0.0271.312±0.071混合菌1.772±0.0881.436±0.019

2.4 組胺降解菌的生長(zhǎng)特性

2.4.1 菌株的生長(zhǎng)能力和產(chǎn)酸能力

能用做香腸發(fā)酵劑的菌株需要有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力和產(chǎn)酸能力。由圖6和圖7可知，3株菌的生長(zhǎng)能力和產(chǎn)酸能力為19號(hào)高于41號(hào)高于46號(hào)，在培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基的pH值均低于5.0，說明3株菌均具有較好的產(chǎn)酸能力，符合生產(chǎn)發(fā)酵香腸的基本要求。

圖6 菌株的生長(zhǎng)能力Fig.6 The growth ability of strains

圖7 菌株的產(chǎn)酸能力Fig.7 The acid producing ability of strains

2.4.2 菌株的耐食鹽和耐亞硝酸鹽能力

能用于香腸發(fā)酵劑的菌株需要能耐受60 g/L的食鹽和150 mg/kg的亞硝酸鹽。由圖8和圖9可知，當(dāng)食鹽質(zhì)量濃度低于60 g/L時(shí)3株菌均能生長(zhǎng)，當(dāng)質(zhì)量濃度升高到80 g/L時(shí)，3株菌培養(yǎng)24h后的OD值均低于0.2，這是由于較高的食鹽濃度增加了滲透壓從而抑制了菌株的生長(zhǎng)活性；亞硝酸鹽濃度在0～200 mg/kg范圍內(nèi)，3株菌均能較好地生長(zhǎng)。該結(jié)果表明，3株菌耐受一定濃度的食鹽和亞硝酸鹽，符合生產(chǎn)發(fā)酵香腸的發(fā)酵劑的基本要求。

圖8 菌株的耐食鹽能力Fig.8 The resistant to salt of strains

圖9 菌株的耐亞硝酸鹽能力Fig.9 The resistant to nitrite of strains

2.4.3 不同pH和溫度下的生長(zhǎng)能力

香腸的發(fā)酵和成熟溫度通常在10～20 ℃之間，香腸成熟時(shí)pH值通常在5.2～5.6之間。由圖10和圖11可知，3株菌均可在一定的低溫和低pH值情況下生長(zhǎng)，能滿足香腸發(fā)酵的要求。

圖10 不同pH值下3菌株的生長(zhǎng)能力Fig.10 The growth ability at different pH

圖11 不同溫度下3菌株的生長(zhǎng)能力Fig.11 The growth ability at different temperature

2.5 四川香腸加工過程中組胺含量的變化

由圖12可知，香腸發(fā)酵結(jié)束時(shí)(2 d)未檢測(cè)到組胺，而在香腸成熟的整個(gè)過程中，未接種組和接種組的組胺含量均呈上升趨勢(shì)，與孫霞等[19]結(jié)果相似。這可能是因?yàn)樵先庵薪M氨酸含量較低，隨著成熟過程中大量的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生組氨酸，而組氨酸在微生物的作用下產(chǎn)生組胺而不斷積累。香腸成熟時(shí)(30 d)，接種組的組胺含量(46.56 mg/kg)比未接種組的組胺含量(66.77 mg/kg)降低了30.26%，說明混合發(fā)酵劑確實(shí)能顯著降低(p<0.05)四川香腸中組胺的含量。但是，由抑菌實(shí)驗(yàn)可知發(fā)酵劑對(duì)產(chǎn)胺菌也具有較強(qiáng)的抑制作用，有多少組胺是通過發(fā)酵劑產(chǎn)生的氧化酶降解而減少的，有多少組胺是由于產(chǎn)胺菌被抑制而減少的，還有待深入研究。

圖12 組胺含量的變化Fig.12 The change of histamine content during fermentation

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過平板顯色法和高效液相色譜法能對(duì)組胺降解菌進(jìn)行有效地分離篩選，得到符合發(fā)酵劑相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，能較好地降解組胺含量且為食源性的乳酸菌共3株，分別為植物乳桿菌、戊糖片球菌和混淆魏斯氏菌，對(duì)組胺的降解率分別達(dá)23.07%、17.90%、14.48%。3株菌之間無明顯拮抗作用，具有較好的生長(zhǎng)能力和產(chǎn)酸能力，能耐受低溫、低pH值、60 g/L的食鹽及150 mg/kg的亞硝酸鹽，滿足發(fā)酵香腸的生產(chǎn)要求。混合菌株比單一菌株能更好地抑制產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)。香腸成熟30 d時(shí)，接種組按照1∶1∶1的比例混合，可顯著降低組胺含量。本研究結(jié)果表明，在四川香腸發(fā)酵過程中接種專門篩選的乳酸菌可以降低其組胺的含量，這對(duì)于提升傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的食用安全性具有重要的意義。

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