蔡針華，程娜，賈震虎*，逄曉陽(yáng)

1(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 臨汾,041000) 2(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京,100193)

乳酸菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，是一類(lèi)能利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸，并對(duì)人體健康有特殊作用的重要益生菌。進(jìn)入宿主腸道后可以通過(guò)生物拮抗作用抑制病原菌的粘附定植[1]和生長(zhǎng)繁殖[2-3]，在宿主腸道發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。據(jù)報(bào)道乳酸菌具有促進(jìn)食物消化與吸收、降低血清膽固醇、抑制病原菌和抗感染、抗腫瘤及預(yù)防衰老等作用[5]。迄今為止，對(duì)乳酸菌粘附和定植腸道的詳細(xì)機(jī)制仍在探索之中，但是目前學(xué)術(shù)界關(guān)于乳酸菌腸道黏附已經(jīng)達(dá)成的初步共識(shí)是，腸道菌群和宿主免疫系統(tǒng)通過(guò)相互作用減少炎癥反應(yīng)，對(duì)維持機(jī)體微生態(tài)平衡發(fā)揮著重要作用[6]。隨著研究的不斷深入，有關(guān)乳酸菌的研究已涉及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，包括乳酸菌的鑒定和分類(lèi)、與粘膜免疫機(jī)制、益生作用及表達(dá)系統(tǒng)等[7]。研究者發(fā)現(xiàn)乳酸菌菌群的群體行為跟很多生物現(xiàn)象相關(guān)，比如生物膜形成[8]、自溶[9]、腸道定植能力等，所以大量研究開(kāi)始關(guān)注乳酸菌的群體行為，而細(xì)菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象是研究菌群群體行為的突破口[10]。

細(xì)菌的群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)是通過(guò)菌體向周?chē)h(huán)境中分泌群體感應(yīng)信號(hào)分子，同時(shí)菌體細(xì)胞膜上具有感知這種信號(hào)分子的受體，當(dāng)菌群密度達(dá)到一定閾值的時(shí)候，菌體細(xì)胞膜上的信號(hào)分子受體感受到這種密度壓力后，通過(guò)磷酸化的方式將QS信號(hào)傳遞給調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控蛋白，通過(guò)調(diào)控蛋白對(duì)菌體的生理代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。細(xì)菌種間交流主要是通過(guò)自體誘導(dǎo)劑-2(Autoinducer-2，AI-2)來(lái)完成的[11]，AI-2主要是由保守的LuxS蛋白酶在甲基循環(huán)中催化合成，這種信號(hào)分子存在于大多數(shù)細(xì)菌中，在許多微生物進(jìn)行種內(nèi)和種間的交流起到了關(guān)鍵的作用。目前已報(bào)道在超過(guò)80種細(xì)菌中存在luxS基因[12-13]，不僅在致病菌中有l(wèi)uxS基因，許多益生菌中也擁有l(wèi)uxS基因并能夠生成AI-2[12,14-15]。研究表明，luxS介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌多種生理現(xiàn)象具有重要的調(diào)控作用[16]，因此深入研究乳酸菌luxS基因的功能將為后續(xù)解析乳酸菌群體感應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路、探索乳酸菌在宿主腸道內(nèi)粘附定植的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

8株乳酸菌均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。大腸埃希氏菌 DH5α 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。哈維弧菌 BB152 (VibrioharveyiBB152)，哈維弧菌 BB170 (VibrioharveyiBB170)、均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB液體培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨(TRYPTONE)(OXOID 公司)、5 g酵母提取物(YEAST EXTRACT)(OXOID公司)、10 g NaCl(生工生物)，使溶質(zhì)完全溶解，調(diào)節(jié) pH值至7.5，定容至1 L，121 ℃，15 min滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

AB培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基中加入0.05 mol/L MgSO4(AMRESCO 公司)，0.3 mol/L NaCl(AMRESCO公司)，0.2% vitamin-free Casamino Acids(BD公司), 用KOH(AMRESCO公司)調(diào)pH至7.5，121 ℃，15 min滅菌后添加10 mL 1 mol/L K2HPO4(AMRESCO公司)(0.22 μm濾器過(guò)濾)，10 mL 0.1 mol/LL-精氨酸(AMRESCO 公司)(0.22 μm 濾器過(guò)濾)，20 mL 50%甘油(0.22 μm濾器過(guò)濾)。

MRS液體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；MB液體培養(yǎng)基、MB固體培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、細(xì)菌RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

凝膠成像儀(GelDocXR+，美國(guó)伯樂(lè)公司)；快速梯度PCR儀(TP600)，日本TAKARA公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7500)，美國(guó)Perkin ELmer公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(SPARK20M)，瑞士TECAN公司；恒溫培養(yǎng)箱(OJ5-2012R)，上海精密儀器有限公司；恒溫金屬浴(MB-102)，杭州博日科技有限公司。

1.4 菌種保藏活化及各生長(zhǎng)時(shí)期的確定

從70多株乳酸菌中經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)挑選8株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株

將凍存的8株乳酸菌分別活化3代。每代于37 ℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)培養(yǎng)3代即可用于實(shí)驗(yàn)。BB170和BB152凍干粉復(fù)蘇，劃線于MB平皿，28 ℃恒溫箱靜置至生長(zhǎng)出大小適宜的單菌落。隨后挑單菌落于MB液體培養(yǎng)基中，每代于28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化培養(yǎng)3代即可用于實(shí)驗(yàn)。取商品化DH5α，于LB

液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h至指數(shù)期，每代于37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h，連續(xù)培養(yǎng)3代即可用于實(shí)驗(yàn)，每次使用按4%的接種量接種于新鮮MRS培養(yǎng)基中。取活化好的乳酸菌菌液以4%的接種量于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中混勻，取1 mL于24孔透明酶標(biāo)板中，用多功能酶標(biāo)儀每隔1 h測(cè)1次OD600 nm值，繪制生長(zhǎng)曲線確定各菌株的指數(shù)期，平臺(tái)期。

1.5 生物學(xué)方法檢測(cè)信號(hào)分子AI-2

將已活化好的8株乳酸菌按4%接種至滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18 h(平臺(tái)期)大約109CFU/mL，將菌液6 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm的滅菌濾菌器過(guò)濾分裝至2 mL離心管中，得到各乳酸菌的無(wú)菌上清液；按相同方法收集28 ℃振蕩培養(yǎng)13 h的V.harveyiBB152無(wú)菌上清液和37 ℃培養(yǎng)的DH5α無(wú)菌上清液分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；所得無(wú)菌上清液分別貯藏于-80 ℃冰箱備用。

將報(bào)告菌株培養(yǎng)至菌體OD600 nm為0.8～1.2，然后用新鮮的AB培養(yǎng)基以1∶5 000的比例與報(bào)告菌株混勻。分別將各乳酸菌、V.harveyiBB152、DH5α無(wú)菌上清液作為待測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，經(jīng)條件優(yōu)化后按1∶100混合于稀釋后的報(bào)告菌株培養(yǎng)液中，置于30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。不加任何菌液的只有稀釋過(guò)的報(bào)告菌株培養(yǎng)液作為介質(zhì)對(duì)照，1～6 h內(nèi)，每隔1 h取200 μL至96孔黑色酶標(biāo)板中，用多功能酶標(biāo)儀的生物發(fā)光模式檢測(cè)其熒光強(qiáng)度值，在1～6 h內(nèi)，以陰性對(duì)照組熒光強(qiáng)度值降到最小的時(shí)間點(diǎn)為基準(zhǔn)，此時(shí)陽(yáng)性組相對(duì)熒光強(qiáng)度設(shè)為1,信號(hào)分子AI-2的強(qiáng)度用相對(duì)熒光表示。樣品與對(duì)照均做3個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照以下方式計(jì)算各菌株熒光強(qiáng)度：陰性對(duì)照組熒光強(qiáng)度為陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度值與陽(yáng)性對(duì)照的熒光強(qiáng)度值之比；待測(cè)組相對(duì)熒光強(qiáng)度值為待測(cè)樣品的熒光值與介質(zhì)對(duì)照熒光值之比。

1.6 luxS基因的生物學(xué)鑒定

1.6.1 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù) NCBI上luxS基因的DNA全長(zhǎng)序列(No.1063754)，應(yīng)用Oligo7設(shè)計(jì)內(nèi)參引物(16S rRNA-F和16S rRNA-R) 及特異性引物 (LuxS-F和LuxS-R)、(LDH-F和LDH-R)并由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，具體引物序列見(jiàn)表2。

1.6.2 菌種RNA提取及cDNA合成

將4株乳酸菌按4%的接種量轉(zhuǎn)接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h至平臺(tái)期，離心收集菌體細(xì)胞，按照常規(guī)Trizol法提取菌體總RNA。cDNA按如下體系進(jìn)行合成：3μL RNA(1 μg)溶液中加入 4 μL Mix和 1 μL gDNA Remove，Rnase-free Water至20 μL,輕輕混勻后 42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s以獲得cDNA。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：Tip Green Qpcr SuperMix 10 μL,ddH2O 8.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，Passive Reference Dye(50×) 0.4 μL,模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件為 95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 34s，40個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.7 乳酸菌種內(nèi)不同pH下信號(hào)分子AI-2與菌體密度的關(guān)系

將篩選出高產(chǎn)AI-2信號(hào)的乳酸菌AST18進(jìn)行耐酸性與信號(hào)分子AI-2的研究，備好的菌液按4%接種到不同pH培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，按1.3.2的方法檢測(cè)不同pH培養(yǎng)條件下乳酸菌AI-2的情況。樣品與對(duì)照均做3個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 各菌株生長(zhǎng)周期的確定

結(jié)合表1和圖1選取實(shí)驗(yàn)室的8株乳酸菌是因?yàn)樗麄冊(cè)谶B續(xù)活化3代培養(yǎng)18 h后，經(jīng)平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)都是109CFU/mL，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀獲得各乳酸菌的生長(zhǎng)曲線，它們有相同的生長(zhǎng)周期，在培養(yǎng)18 h后都達(dá)到了對(duì)數(shù)末期，保證了幾株菌的菌群密度一致性，幾株菌又是實(shí)驗(yàn)室研究較多的，遺傳背景比較清楚，故實(shí)驗(yàn)選取這8株乳酸菌來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，乳酸菌產(chǎn)信號(hào)分子AI-2通常都在對(duì)數(shù)末期或者穩(wěn)定初期達(dá)到最高[17-18]，這可能是由于大量 AI-2信號(hào)分子隨著菌體密度的增高而增多，但當(dāng)其濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，發(fā)生的內(nèi)化作用，菌體重吸收或附著在細(xì)胞膜表面，調(diào)控穩(wěn)定期的某些重要生理功能[18]。由圖1顯示，8株乳酸菌大概從3 h進(jìn)入指數(shù)期，10 h到達(dá)指數(shù)末期，之后進(jìn)入平臺(tái)期，OD600 nm在指數(shù)末期達(dá)到最大，在18 h時(shí)OD600 nm趨于穩(wěn)定，處于平臺(tái)期，因此實(shí)驗(yàn)中選擇培養(yǎng)18 h時(shí)測(cè)定不同乳酸菌產(chǎn)信號(hào)分子 AI-2的熒光強(qiáng)度。

圖1 8株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of eight strains of lactic acid bacteria

2.2 菌株培養(yǎng)上清AI-2信號(hào)檢測(cè)

結(jié)合已研究的方法[17-20]進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)中用到的指示菌株V.harveyiBB170是標(biāo)準(zhǔn)菌株V.harveyiBB120的定向突變菌株，產(chǎn)信號(hào)分子AI-2的luxS基因是完整的，所以選它為報(bào)告菌株。不同細(xì)菌產(chǎn)生的信號(hào)分子AI-2，都能被報(bào)告菌株V.harveyBB170識(shí)別，誘導(dǎo)其熒光酶基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)[21]。V.harveyBB152也是突變體且只能產(chǎn)生信號(hào)分子AI-2，故作為陽(yáng)性對(duì)照[17]，大腸埃氏菌DH5α由于缺失luxS基因不能產(chǎn)生AI-2信號(hào)，故作為陰性對(duì)照。由圖2可知，在0～3 h內(nèi)所有對(duì)照組的熒光強(qiáng)度均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而在不斷下降，且陰性對(duì)照在3 h時(shí)熒光強(qiáng)度已經(jīng)達(dá)到最低，之后開(kāi)始升高，由于陰性對(duì)照中只包含稀釋后的報(bào)告菌株，表明當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，指示菌產(chǎn)生的信號(hào)分子AI-2濃度達(dá)到誘導(dǎo)其發(fā)光的閾值。因此，以3 h時(shí)的熒光強(qiáng)度值為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各菌株相對(duì)熒光強(qiáng)度，表示信號(hào)分子AI-2活性。依據(jù)文獻(xiàn)[22]研究發(fā)現(xiàn)，V.harveyiBB170構(gòu)成的AI-2檢測(cè)體系對(duì)pH值較敏感，過(guò)酸或者過(guò)堿均會(huì)對(duì)指示菌的發(fā)光性產(chǎn)生影響。從最優(yōu)角度出發(fā)，按照1∶100的加樣比例添加，此時(shí)體系中既含有足夠量的AI-2信號(hào)分子足以誘導(dǎo)V.harveyiBB170產(chǎn)生熒光，同時(shí)又避免了培養(yǎng)上清液中酸度和抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌的影響[19]。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，8株乳酸菌的相對(duì)熒光強(qiáng)度只有1株SY13小于陰性對(duì)照，說(shuō)明其中7株乳酸菌均可以產(chǎn)信號(hào)分子AI-2，其中乳酸菌YL-6、AST18和ZNJ160201的相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯高于其他幾株，乳酸菌LGG、YL-LGG-ATCC和LJJ的相對(duì)熒光強(qiáng)度較弱。

圖2 不同孵育時(shí)間各樣品的熒光強(qiáng)度值Fig.2 The luminescence of different incubation time of samples

圖3 各乳酸菌培養(yǎng)18 h上清液的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.3 The relative luminescence of lactic acid bacteria in incubation time 18 h

2.3 RT-PCR檢測(cè)luxS基因表達(dá)情況

已被證明[23]在細(xì)菌物種中導(dǎo)致產(chǎn)生AI-2的生物合成途徑是高度保守的，且已經(jīng)在不同乳桿菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了LuxS同源物，同時(shí)早些時(shí)候已經(jīng)研究了一些乳桿菌屬物種產(chǎn)生AI-2的情況[22，24-25]。參與AI-2生物合成的重要酶是S-核糖基半胱氨酸酶，也稱(chēng)為L(zhǎng)uxS蛋白，基因組分析發(fā)現(xiàn)55種以上的細(xì)菌均含有AI-2合成酶luxS的同源保守序列[26]。選取其中乳酸菌AST18、ZNJ160201和SY13、YL-LGG-ATCC這4株菌用生物學(xué)方法來(lái)檢測(cè)AI-2熒光強(qiáng)度是否是由關(guān)鍵基因luxS所控制和熒光方法的準(zhǔn)確性。對(duì)4株乳酸菌進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，luxS基因的表達(dá)情況如圖4。luxS基因在乳酸菌AST18、ZNJ160201表達(dá)較強(qiáng)，在YL-LGG-ATCC表達(dá)較弱，而在SY13菌株中幾乎沒(méi)有表達(dá)，與圖2的熒光結(jié)果較一致，同時(shí)通過(guò)結(jié)合兩種檢測(cè)結(jié)果，說(shuō)明AI-2熒光強(qiáng)度是由關(guān)鍵基因luxS所控制。

圖4 四株乳酸菌luxS基因和LDH基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of luxS gene and LDH gene of four lactic acid bacteria

LEBEE[24]等人已經(jīng)研究得出luxS基因在乳酸菌中有中樞代謝作用。同時(shí)群體感應(yīng)必不可少可能伴隨著能量反應(yīng)，luxS基因可能間接的參與了EMP,磷酸戊糖和TCA等循環(huán)，因而實(shí)驗(yàn)又選擇LDH基因來(lái)檢測(cè)QS系統(tǒng)與新陳代謝之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)當(dāng)luxS基因表達(dá)較強(qiáng)時(shí)，而LDH基因表達(dá)較弱，LDH基因編碼乳酸脫氫酶的生成，進(jìn)而催化丙酮酸生成乳酸，乳酸是谷氨酸發(fā)酵的主要副產(chǎn)物，所以當(dāng)luxS基因表達(dá)較強(qiáng)時(shí)，LDH基因相對(duì)較弱，乳酸生成相對(duì)較少，有利于宿主體內(nèi)腸道的酸堿平衡，繼而維持腸道菌群平衡，從而在腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用。對(duì)這4株菌進(jìn)行基因組提取，普通PCR擴(kuò)增后，經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，與實(shí)時(shí)熒光聚合酶列式反應(yīng)結(jié)果一致，說(shuō)明菌株AST18和ZNJ160201的AI-2信號(hào)強(qiáng)，luxS基因表達(dá)較強(qiáng)，AI-2信號(hào)強(qiáng)度是由關(guān)鍵基因luxS所主導(dǎo)。同時(shí)通過(guò)3個(gè)結(jié)果的一致性也說(shuō)明了熒光檢測(cè)與RT-PCR檢測(cè)相結(jié)合是比較準(zhǔn)確的方法用于群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2的檢測(cè)。

圖5 LuxS基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of luxS gene amplified by PCR

2.4 生物發(fā)光與耐酸性特性研究

據(jù)報(bào)道[27],有機(jī)酸、蘋(píng)果酸對(duì)致病菌AI-2信號(hào)的產(chǎn)生有抑制作用。luxS基因參與環(huán)境調(diào)控脅迫，如酸性脅迫已經(jīng)在變形鏈球菌中被證明[28-29]，但是該基因在乳酸桿菌中酸適應(yīng)的作用尚不清楚。實(shí)驗(yàn)探究乳酸菌在強(qiáng)酸環(huán)境中生長(zhǎng)后AI-2信號(hào)變化情況，結(jié)果如圖6，乳酸菌在不同pH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，AI-2信號(hào)也大不相同。在菌體數(shù)達(dá)到一定閾值時(shí)，能夠激發(fā)報(bào)告菌株發(fā)光酶的活性，誘導(dǎo)報(bào)告菌株發(fā)光，酸性越強(qiáng)AI-2信號(hào)越強(qiáng)。當(dāng)pH等于3.5時(shí)，菌體密度幾乎是最低的，但是AI-2信號(hào)是最強(qiáng)的。而當(dāng)pH等于2.5時(shí)，過(guò)酸的環(huán)境不利于菌體的生長(zhǎng)，可能是菌體數(shù)沒(méi)有達(dá)到閾值，所以AI-2信號(hào)較弱，上述所得結(jié)果與1.3中檢測(cè)的LDH基因和luxS基因的表達(dá)相符合。這樣的結(jié)果說(shuō)明AI-2信號(hào)提高了乳酸菌酸脅迫作用，繼而發(fā)揮其腸道益生作用；同時(shí)也說(shuō)明菌體密度并不是群體感應(yīng)變化的主要原因，可能與其所處的環(huán)境有極大的關(guān)系。為以后研究乳酸菌通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)腸道菌群平衡及發(fā)揮免疫功能提供了一定的幫助。

圖6 不同pH條件下熒光強(qiáng)度與OD600 nm的關(guān)系Fig.6 The relationship of light intensity and OD600 nm under unequal pH condition

3 結(jié)論

本研究篩選出3株高產(chǎn)群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2乳酸菌，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)證明了熒光篩選方法的可靠性，同時(shí)確定了luxS基因編碼的LuxS蛋白是控制群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2的主要酶。同時(shí)得出在酸性環(huán)境中AI-2信號(hào)更強(qiáng)，說(shuō)明乳酸菌能夠通過(guò)群體系統(tǒng)的調(diào)控在酸性腸道內(nèi)存活，并調(diào)控腸道菌群平衡，發(fā)揮其免疫功能。本研究為下一步研究luxS突變株與群體感應(yīng)，免疫調(diào)節(jié)功能等關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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