呂鑫,王騰飛,汪俊卿,劉洪玲,王瑞明*

1(齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南，250353) 2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300222)

海藻糖是自然界中天然存在的一種非還原性二糖，是麥芽糖的同分異構(gòu)體，由兩分子的葡萄糖通過(guò)α,α-1,1-糖苷鍵連接構(gòu)成[1-2]。在細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)和一些無(wú)脊椎動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)了海藻糖的存在[3-5]，其主要功能是作為儲(chǔ)能物質(zhì)和細(xì)胞壁的組成成分[6-7]。隨著研究的不斷深入，海藻糖在食品、藥品、化妝品及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[8-9]。

海藻糖合酶(Treshalose synthase， TreS)能夠?qū)Ｒ恍运恹溠刻巧珊Ｔ逄荹10]，其底物專(zhuān)一性強(qiáng)，為廉價(jià)的麥芽糖[11]。目前已經(jīng)有多種來(lái)源的海藻糖合酶基因被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行了異源表達(dá)，但TreS轉(zhuǎn)化底物麥芽糖生產(chǎn)海藻糖的轉(zhuǎn)化率較低，因此，對(duì)海藻糖合酶進(jìn)行分子改造是非常必要的。目前，有3種不同來(lái)源的TreS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析，分別是來(lái)源于Deinococcusradiodurans(PDB ID:4tvu)[12]、Mycobacteriumtuberculosis(PDB ID:4lxf)[13]、Mycobacteriumsmegmatis(PDB ID:3zo9)[14]的海藻糖合酶。TreS屬于糖苷水解酶13家族(GH13)，包含ABC 3個(gè)結(jié)構(gòu)域，其A結(jié)構(gòu)域內(nèi)的(α/β)8桶狀區(qū)域是催化主體結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部主要由兩個(gè)天冬氨酸(Asp)和一個(gè)谷氨酸(Glu)構(gòu)成催化三聯(lián)體[12]。相比隨機(jī)突變，通過(guò)同源建模得到蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)及氨基酸序列比對(duì)方法，理性設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)，能夠在較小的突變庫(kù)中得到性質(zhì)提高的突變體，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子改造[15-16]。目前有多種來(lái)源的TreS通過(guò)分子改造提高了酶的特性，如李珍珍等人對(duì)來(lái)源于PseudomonasstutzeriQLU3的海藻糖合酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)底物進(jìn)出通道是海藻糖合酶反應(yīng)的限速步驟，通過(guò)改變通道大小，將底物進(jìn)出口的一些氨基酸定點(diǎn)突變后，得到一個(gè)轉(zhuǎn)化率提高4.5%的突變體[17]。宿玲怡等人通過(guò)多序列比對(duì)和同源建模的方法，將來(lái)源于Thermusthermophilus的TreS活性中心保守區(qū)附近的氨基酸突變后，突變體轉(zhuǎn)化率達(dá)到62%比原始酶提高13%[18]。

本研究室篩選得到的PseudomonasputidaP06，其產(chǎn)生的海藻糖合酶溫度和pH耐受性比較強(qiáng)，在40 ℃以下，pH 8.0～9.0條件下表現(xiàn)出較高的酶活[19]。通過(guò)基因工程手段，已經(jīng)將該TreS基因成功導(dǎo)入到大腸桿菌中，使蛋白表達(dá)量得到大幅提高[20]。但因該酶的轉(zhuǎn)化率難以滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，因此有必要通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段改造TreS提高其酶促反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)同源建模得到海藻糖合酶的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，并與底物麥芽糖進(jìn)行了分子對(duì)接，結(jié)合多序列比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建飽和突變庫(kù)，篩選得到了轉(zhuǎn)化率提高的突變體并對(duì)突變體的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為下一步海藻糖合酶的改造和工業(yè)化應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coliDH5α(含pET-15b-TreS質(zhì)粒)為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；E.coliBL21(DE3) 超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞為克隆表達(dá)宿主菌，購(gòu)自Vazyme公司。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

2xPhanta?Max Master Mix購(gòu)自Vazyme公司；Dpn I限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Takara公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L，用于大腸桿菌的培養(yǎng)及誘導(dǎo)。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加20 g/L瓊脂粉。

1.1.3 儀器

Veriti PCR儀；上海知楚ZQZY-CS恒溫振蕩培養(yǎng)箱；美國(guó)SONICS超聲破碎儀；日本島津LC-20A高效液相色譜。

1.2 海藻糖合酶及突變酶的結(jié)構(gòu)分析和同源序列比對(duì)

利用I-TASSER進(jìn)行TreS的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，模板為來(lái)源于Mycobacteriumtuberculosis的海藻糖合酶H37Rv (PDB登錄號(hào)：4LXF_A)[13]。TreS與底物麥芽糖的柔性對(duì)接利用AUTODOCK4.0軟件進(jìn)行，結(jié)構(gòu)分析及突變位點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)PyMOL v1.6軟件完成。利用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。通過(guò)分析TreS突變前后氨基酸性質(zhì)變化、疏水相互作用等，分析突變對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3 全質(zhì)粒PCR法構(gòu)建飽和突變庫(kù)

定點(diǎn)飽和突變采用全質(zhì)粒PCR方法進(jìn)行，以提取自E.coliDH5α的PET-15b-TreS質(zhì)粒為模板，以含簡(jiǎn)并引物的 LYS490-F、LYS490-R為引物，引物序列見(jiàn)表1。利用2×Phanta?Max Master Mix高保真聚合酶進(jìn)行突變質(zhì)粒擴(kuò)增，其中PCR反應(yīng)體系為：2×Phanta?Max Master Mix 25μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，68 ℃ 8 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 LYS490飽和突變引物

注：下劃線(xiàn)序列代表突變氨基酸密碼子序列: N=A/T/C/G, K=G/T

將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用Dpn I內(nèi)切酶消化30 min，模板質(zhì)粒是經(jīng)dam甲基化修飾的對(duì)Dpn I敏感而被切碎。酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3) 超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取單克隆至含1 mL LB培養(yǎng)基(含100 μg /mL 氨芐青霉素)的甘油管中，過(guò)夜培養(yǎng)，構(gòu)建飽和突變體庫(kù)，庫(kù)容96個(gè)。

1.4 突變體庫(kù)的誘導(dǎo)表達(dá)

將突變體接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL 氨芐青霉素)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600 nm達(dá)到2.5～3.0時(shí)，添加誘導(dǎo)劑乳糖至終濃度4 g/L，27 ℃，200 r/min條件下誘導(dǎo)8 h。發(fā)酵液于4 ℃，8 000 r/min條件下離心10 min，5 mL 10 mmol/L PBS(pH 8.0)重懸菌體，利用超聲破碎儀提取突變酶，破碎條件：300 W，工作時(shí)間5 s，間歇5 s，全程15 min。破碎液4 ℃，8 000 r/min離心10 min，收集上清液，上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

1.5 突變酶活性檢測(cè)及轉(zhuǎn)化率計(jì)算

取5 mL粗酶液轉(zhuǎn)化底物濃度300 g/L的麥芽糖溶液(pH 8.0)，25 ℃條件下反應(yīng)8 h，沸水浴15 min終止反應(yīng)。室溫13 000 r/min離心15 min，取上清利用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography ，HPLC)檢測(cè)轉(zhuǎn)化體系中海藻糖、葡萄糖、麥芽糖含量。同一突變子重復(fù)3次，測(cè)定值差異小于5%，取平均值。

HPLC測(cè)定方法：色譜柱Inertsil NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相(乙腈∶水=3∶1)；流速(1.0 mL/min)；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃。

海藻糖合酶轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式：

(1)

其中，mtrehalose、mglucose、mmaltose分別代表轉(zhuǎn)化體系中海藻糖、葡萄糖、麥芽糖的質(zhì)量。

1.6 突變酶最適溫度及熱穩(wěn)定性分析

分別在不同溫度(20～65 ℃)下，pH 8.0轉(zhuǎn)化1 h，以最高酶活為100%，測(cè)定原始酶與突變酶的最適反應(yīng)溫度。分別在不同溫度(20～65 ℃)下保溫60 min后，25 ℃、pH 8.0條件下轉(zhuǎn)化1 h，測(cè)定剩余酶活力，比較原始酶與突變酶的熱穩(wěn)定性。

海藻糖合酶酶活力定義：每小時(shí)轉(zhuǎn)化麥芽糖生成1 μmol的海藻糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.7 突變酶最適pH及pH耐受性分析

分別在不同pH(4.0～10)條件下，25 ℃轉(zhuǎn)化1 h，以最高酶活為100%，測(cè)定原始酶與突變酶的最適反應(yīng)pH。分別在pH(4.0～10)條件下，25 ℃保溫60 min后25 ℃、pH 8.0條件下反應(yīng)1 h，計(jì)算剩余酶活力，比較原始酶與突變酶的pH穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 TreS活性中心分析及飽和突變位點(diǎn)的選擇

通過(guò)模擬預(yù)測(cè)的海藻糖合酶的三維結(jié)構(gòu)(如圖1-a所示)，其活性中心與來(lái)源于Mycobacteriumtuberculosis的海藻糖合酶一致，包含1個(gè)(α/β)8桶狀催化區(qū)域，依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，位于該口袋底部的氨基酸殘基是參與底物結(jié)合和親核催化的關(guān)鍵氨基酸[21]。為進(jìn)一步分析TreS的活性中心，通過(guò)AUTODOCK 4.0進(jìn)行小分子配體與酶的柔性對(duì)接，對(duì)接結(jié)果如圖1-b所示。通過(guò)PyMOL軟件分析酶-底物對(duì)接結(jié)果，發(fā)現(xiàn)海藻糖合酶活性中心的9個(gè)氨基酸(D294、E338、D403、D112、F115、F223、F255、Q259、R535)參與底物結(jié)合，前期研究發(fā)現(xiàn)，D294可能是參與親核催化的關(guān)鍵氨基酸[22]。

活性中心附近的氨基酸，雖然不直接參與底物結(jié)合和催化反應(yīng)，但其對(duì)催化過(guò)程起到很大的輔助作用，并在酶促反應(yīng)過(guò)程中，對(duì)酶的構(gòu)象變化起到一定作用。通過(guò)分析TreS活性中心4 ?范圍左右的氨基酸(圖2-a)，發(fā)現(xiàn)490位賴(lài)氨酸位于活性中心附近，靠近可能的催化位點(diǎn)Asp294，并且其位于α螺旋末端，與α螺旋上H493、L494和底物麥芽糖形成4個(gè)氫鍵，其空間位置如圖2-b所示。

a-圖中黑框所示活性中心區(qū)域；b-活性中心參與麥芽糖分子結(jié)合的氨基酸殘基圖1 TreS的三維結(jié)構(gòu)及分子對(duì)接結(jié)果Fig.1 Three-dimensional structure of TreS and the molecular docking results

a-TreS活性中心4?范圍左右的氨基酸；b-Lys 490空間位置及形成的氫鍵圖2 TreS分子對(duì)接結(jié)果分析Fig.2 Analysis of TreS Molecular Docking Results

通過(guò)分析來(lái)源于PseudomonasputidaS1、Pseudomonasmonteilii、Pseudarthrobactersiccitolerans等的海藻糖合酶氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖3)，發(fā)現(xiàn)K490位點(diǎn)并非高度保守，不同來(lái)源的海藻糖合酶基因在此位置表現(xiàn)出差異。綜合以上結(jié)果，認(rèn)為K490位點(diǎn)的突變可能會(huì)對(duì)TreS的催化中心產(chǎn)生一定的影響，對(duì)其催化能力帶來(lái)一定的提高，故選擇該位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，篩選高轉(zhuǎn)化率突變子。

圖3 不同來(lái)源的海藻糖合酶序列比對(duì)Fig.3 Alignment of the amino acid sequence of TreS from different microorganism

2.2 飽和突變庫(kù)的構(gòu)建

利用突變引物以PET-15b-TreS質(zhì)粒為模板，PCR成功對(duì)K490位點(diǎn)進(jìn)行了飽和突變，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示條帶大小約為7 750 bp，符合模板質(zhì)粒大小(如圖4-a所示)。將經(jīng)過(guò)Dpn I酶切處理的片段轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)抗性篩選得到飽和突變體庫(kù)，利用PCR隨機(jī)驗(yàn)證突變子TreS基因，電泳顯示符合目的條帶大小(如圖4-b所示)。

M-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；a-泳道1，飽和突變PCR產(chǎn)物電泳圖；b-泳道1～5，突變子隨機(jī)驗(yàn)證PCR電泳圖圖4 目的基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 DNA electrophoresis of PCR product

2.3 突變子的篩選

按照1.3、1.4所述方法進(jìn)行突變庫(kù)的篩選，經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)得到兩株海藻糖產(chǎn)量明顯提高的突變體，經(jīng)過(guò)基因測(cè)序及序列分析，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)由Lys(賴(lài)氨酸)分別變?yōu)長(zhǎng)eu(亮氨酸)和Ile(異亮氨酸)。HPLC結(jié)果計(jì)算得到，原始酶轉(zhuǎn)率為50%，突變酶K490L轉(zhuǎn)化率為68%，K490I轉(zhuǎn)化率為65%，分別比原始酶提升了18%和15%(如圖5所示)。

圖5 原始酶及突變酶的轉(zhuǎn)化率Fig.5 Conversion rate of primitie enzyme and mutant enzyme

2.4 突變酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

突變酶及原始酶的最適反應(yīng)溫度如圖6-a所示，突變酶K490L,K490I的最適反應(yīng)溫度與原始酶一致，為25 ℃，這說(shuō)明突變氨基酸的引入并不會(huì)改變催化反應(yīng)的最適溫度。原始酶在40 ℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性，而K490L,K490I在45 ℃保溫1 h后，剩余酶活力仍能保持在80%以上，相比原始酶得到大幅度的提高，在超過(guò)50 ℃時(shí)酶活迅速下降(圖6-b)。

圖6 突變酶的最適反應(yīng)溫度(a)及熱穩(wěn)定性(b)Fig.6 The optimum reaction temperature (a) and thermal stability (b) of mutant enzyme

2.5 突變酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

原始酶和突變酶的最適反應(yīng)pH如圖7-a所示，突變酶K490L,K490I的最適反應(yīng)pH沒(méi)有發(fā)生遷移，在pH8.0時(shí)表現(xiàn)出最大酶活力。原始酶在pH 7.5～9.0之間時(shí)保持較高酶活，而突變酶K490L,K490I在pH 7.0保溫1 h時(shí)仍保持80%以上酶活力，當(dāng)pH低于7.0時(shí)，酶活迅速降低，在較低的pH條件下，酶活直接喪失(如圖7-b)。

2.6 突變位點(diǎn)的分析

亮氨酸和異亮氨酸都是非極性的疏水性氨基酸，二者的化學(xué)性質(zhì)極為相似。通過(guò)PyMOL軟件分析突變后的TreS活性中心發(fā)現(xiàn)，490位氨基酸由Lys(圖8a)突變?yōu)長(zhǎng)eu(圖8b)和Ile(圖8c)后，氨基酸性質(zhì)發(fā)生了改變，活性中心的疏水作用得到增強(qiáng)，對(duì)于提高底物結(jié)合能力和催化反應(yīng)具有一定的幫助。Leu和Ile較Lys疏水性增強(qiáng)，提高了該位點(diǎn)附近的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[23]，使形成的結(jié)合口袋更加緊密，對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中形成的葡萄糖分子形成了有效的空間位阻，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)物海藻糖的形成，提高了反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。490位點(diǎn)位于α螺旋末端，在α螺旋引入強(qiáng)疏水性氨基酸，對(duì)海藻糖合酶的穩(wěn)定性和底物結(jié)合能力都有重要的影響，疏水作用的增強(qiáng)也會(huì)增加蛋白的穩(wěn)定性[24]，因此K490L和K490I的熱穩(wěn)定性也有所提高。張悅等人對(duì)嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)海藻糖合酶α螺旋末端的Pro突變?yōu)長(zhǎng)eu后，延長(zhǎng)了螺旋結(jié)構(gòu)提高了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，該酶的轉(zhuǎn)化率得到提升[25]。

圖7 突變酶的最適反應(yīng)pH (a)及pH穩(wěn)定性(b)Fig.7 The optimum reaction pH (a) and pH stability(b) of mutant enzymes

a-Lys; b-Leu; c-Ile圖8 突變位點(diǎn)的模擬分析Fig.8 Simulation analysis of mutation sites

3 結(jié)論

本研究對(duì)來(lái)源于PseudomonasputidaP06的海藻糖合酶進(jìn)行了蛋白質(zhì)水平的改造，通過(guò)對(duì)Lys490位點(diǎn)的飽和突變，利用HPLC篩選得到了2株轉(zhuǎn)化率提高的突變體K490L和K490I，兩株突變體的轉(zhuǎn)化率分別為68%和65%，比原始酶提升了18%和15%。酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，K490L和K490I的熱穩(wěn)定性(20～45 ℃)和耐酸性(pH 7.0～9.0)比原始酶顯著增強(qiáng)。通過(guò)PyMOL模擬了突變位點(diǎn)的改變，分析了K490L和K490I轉(zhuǎn)化率提高的原因。該研究表明，Lys490位點(diǎn)的分子改造能夠顯著提高TreS的轉(zhuǎn)化率，且改造后TreS酶學(xué)性質(zhì)實(shí)用性增強(qiáng)，為以后海藻糖合酶的進(jìn)一步改造奠定了理論基礎(chǔ)。

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