任立均，劉龍*，劉松，堵國成，陳堅(jiān)

1(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase, TGase, EC 2.3.2.13)，能夠催化蛋白質(zhì)肽鏈中谷氨酰胺殘基的 γ-羧酰胺基與賴氨酸 ε-?；蚱渌；磻?yīng)，形成 ε-(γ-谷氨?；?賴氨酸共價(jià)鍵，從而使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，達(dá)到提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)以及改善蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的目的。特殊的催化能力使得該酶作為一種新型的酶制劑被廣泛應(yīng)用于食品工程、材料工程、紡織與皮革加工、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。然而，較低的熱穩(wěn)定性使商品化的TGase主要通過高能耗的冷凍干燥制備酶粉，同時(shí)常溫下液體TGase儲(chǔ)存穩(wěn)定性不佳。因此，選擇適合的保護(hù)劑提高TGase的熱穩(wěn)定性對該酶的應(yīng)用有重要意義[2]。

目前，關(guān)于TGase熱穩(wěn)定性的研究已有大量報(bào)道。基于重組表達(dá)系統(tǒng)，研究者對TGase進(jìn)行分子改造提高酶穩(wěn)定性，包括定點(diǎn)突變[3]、融合雙親短肽[3]、引入二硫鍵[4]等。此外，固定化TGase[5]和鄰苯二甲酸酐修飾亦被用于TGase的穩(wěn)定化改造[6]。盡管分子改造及化學(xué)修飾能有效改善TGase的熱穩(wěn)定性，但由于轉(zhuǎn)基因及化學(xué)殘留的安全隱患限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。通過添加食品安全的穩(wěn)定劑能有效避免上述問題，是一種經(jīng)濟(jì)、便捷、有效的酶穩(wěn)定化方法。已有的研究表明，糖類(海藻糖、蔗糖、果糖)[7-10]、醇類[11-13]、鹽類[14]能有效提高堿性磷酸酶、過氧化氫酶、木瓜蛋白酶等的熱穩(wěn)定性。

本研究首先通過單因素實(shí)驗(yàn)從糖類、鹽類、醇類等中篩選對TGase熱穩(wěn)定性有明顯作用的穩(wěn)定劑，然后進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，獲得了能顯著提高TGase熱穩(wěn)定性的配方。研究結(jié)果將進(jìn)一步促進(jìn)TGase的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

StreptoverticilliummobaraenseTGase(酶活≥1 500 U/g)，小麥蛋白：江蘇一鳴生物制品有限公司；N-carboxybenzoyl-L-glutaminylglycine (N-CBZ-Gln-Gly)，L-谷氨酸-γ-單羥胺酸：色譜純，上海Sigma-Aldrich 公司；還原型谷胱甘肽：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白胨：分析純，英國Oxoid公司；脫脂奶粉：澳大利亞Devondale Murray Goulburn合作社；大豆蛋白：分析純，河南恒銳食品添加劑有限公司；精氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、亮氨酸：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙三醇、山梨醇、聚乙二醇1000(Polyethylene glycol 1000, PEG1000)、葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、海藻糖、NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4：分析純，上海國藥集團(tuán)。

1.1.2 主要溶液[3]

(1) 溶液A(反應(yīng)底物液)

0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH 6.0)、0.1 mol/L鹽酸羥胺、0.01 mol/L還原型谷胱甘肽、10 g/L CBZ-GLN-GLY(Nalpha-Carbobenzyloxy-Glutamine Glycine)(溶于0.2 mol/L NaOH中)4種試劑以2∶1∶1∶1混合配置，pH 6.0，現(xiàn)配現(xiàn)用，冰箱存放。

(2) 溶液B(終止劑)

3 mol/L HCl、12%三氯乙酸、5% FeCl3· 6 H2O(溶于0.1 mol/L HCl中)3種試劑以1∶1∶1混合配制。

(3) 磷酸鹽緩沖液

0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.4。

1.2 儀器與設(shè)備

DKB-600A型電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高速離心機(jī)(CR22GⅡ)；日本 HITACHI 公司；紫外可見光分光光度計(jì)(Shimadzu UV-2450)；日本 Shimadzu 公司；Cytation3細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)；美國伯騰儀器有限公司；Eppendorf 5424 高速離心機(jī)；美國 Eppendorf 公司；pH計(jì)，瑞士 Mettler-Toledo公司；制冰機(jī)，北京科創(chuàng)百方科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

TGase酶粉用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液溶解，定量稱取各種穩(wěn)定劑，使酶粉分別與各個(gè)穩(wěn)定劑充分混溶，控制各實(shí)驗(yàn)組中TGase的初始酶活在1.5 U/mL左右，穩(wěn)定劑的質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40、50 g/L。

1.3.2 TGase酶活測定

比色法測定酶活[15]。用 α-N-CBZ-Gln-Gly 為作用底物，L-谷氨酸-γ-單羥胺酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。1個(gè)單位TGase 酶活定義為：在37 ℃條件下，每分鐘催化上述底物形成 1 μmol的L-谷氨酸-γ-單羥胺酸的酶量(U/mL)。 酶活測定條件為37 ℃條件下反應(yīng)10 min。

1.3.3 TGase熱穩(wěn)定性檢測

本實(shí)驗(yàn)以TGase的t1/2(55 ℃)(即TGase在55 ℃熱處理下酶活降低到初始酶活一半所需的時(shí)間)作為衡量TGase熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。同時(shí)用55 ℃水浴處理預(yù)冷的對照組TGase和實(shí)驗(yàn)組TGase，前30 min內(nèi)每隔3 min取樣，之后每隔10 min 取樣，樣品立即置于冰上冷卻3 min，隨后按照1.3.2測TGase的殘余酶活力。酶的t1/2可通過作活力-時(shí)間圖解得[16]。

1.3.4 TGase最適反應(yīng)溫度測定

按照1.3.2測定不同溫度下TGase的酶活，定義37 ℃下各組的殘余酶活率為100%，比較添加復(fù)合配方的實(shí)驗(yàn)組與對照組的殘余酶活率。

1.3.5 TGase在不同溫度下的熱穩(wěn)定性檢測

將各組在不同溫度下熱處理1 h后按照1.3.2測定各組保溫前后TGase的酶活，定義各組的殘余酶活率為：

1.3.6 TGase常溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性檢測

將各組在常溫(25 ℃)下儲(chǔ)存80 d，每隔10天按照1.3.2測定各組TGase的酶活，定義各組第0天的殘余酶活率為100%，比較實(shí)驗(yàn)組與對照組儲(chǔ)存不同時(shí)間的殘余酶活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖對TGase熱穩(wěn)定性的影響

糖類是一種常被用來研究酶熱穩(wěn)定性的穩(wěn)定劑，糖類中的氫鍵能夠降低蛋白質(zhì)的自由能，這對維持蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要的作用[17]。本實(shí)驗(yàn)選用了4種糖類(葡萄糖、α-乳糖、蔗糖、海藻糖)進(jìn)行研究，結(jié)果如圖1。4種糖類對熱處理下的TGase穩(wěn)定性均有積極影響。其中50 g/L葡萄糖的保護(hù)效果最為明顯，55 ℃下TGase的t1/2達(dá)到了34.74 min，比對照9.74 min提高了256.67%。大量的報(bào)道表明，在酶液中添加糖類，如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖等能有效改善疏水相互作用，改變?nèi)芤旱谋砻鎻埩17]，提高酶的熱穩(wěn)定性。

A-葡萄糖；B-乳糖；C-蔗糖；D-海藻糖圖1 糖類對TGase t1/2(55 ℃)的影響Fig.1 The effects of saccharides on t1/2(55 ℃) of TGase

2.2 醇對TGase熱穩(wěn)定性的影響

多元醇也是一種有效的酶穩(wěn)定劑，山梨醇和甘油是多元醇中最常被用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的兩種，不同的作用機(jī)制被用來解釋這兩種醇對酶的穩(wěn)定作用，包括優(yōu)先水合，包埋蛋白，優(yōu)先排斥變性蛋白等[18]。本實(shí)驗(yàn)選用了3種醇類(山梨醇、甘油、PEG1000)進(jìn)行研究。如圖2，3種醇類均促進(jìn)了TGase熱穩(wěn)定性，其中50 g/L的山梨醇使55 ℃下TGase的t1/2達(dá)到34.81 min，比對照提高257.39%。文獻(xiàn)顯示，甘油和山梨醇能在一定程度上幫助蛋白質(zhì)抵抗熱變性[11-13]。一般認(rèn)為，醇類是通過羥基與酶分子的相互作用[19]及降低介質(zhì)的介電常數(shù)來加強(qiáng)酶分子的疏水作用[20]，從而改善酶的熱穩(wěn)定性。

A-山梨醇；B-甘油；C-PEG1000圖2 醇類對TGase t1/2(55 ℃)的影響Fig.2 The effects of polyols on t1/2(55 ℃) of TGase

2.3 鹽對TGase熱穩(wěn)定性的影響

有研究表明，添加不同的鹽能增加酶的熱穩(wěn)定性[14]。毛新煥等人通過研究一些金屬硫酸鹽還發(fā)現(xiàn)某些金屬的硫酸鹽對辣根過氧化物酶具有一定的穩(wěn)定作用[21]。本實(shí)驗(yàn)選用4種鹽類(NaCl, KCl, NH4Cl, (NH4)2SO4)進(jìn)行研究。如圖3，低濃度KCl、NH4Cl和(NH4)2SO4對TGase的保護(hù)均隨著濃度的增大而作用增強(qiáng)。 50 g/L的KCl、NH4Cl和(NH4)2SO4影響下TGase的t1/2分別較對照提高6.84倍、8.65倍和12.68倍，40 g/L的NaCl使TGase的t1/2達(dá)到107.24 min，較對照提高10倍。這說明選擇的4種金屬陽離子和硫酸根離子均對酶的熱穩(wěn)定有良好的保護(hù)效果。

(A)NaCl；(B)KCl；(C)NH4Cl；(D)(NH4)2SO4圖3 鹽類對TGase t1/2(55 ℃)的影響Fig.3 The effects of salts on t1/2(55 ℃) of TGase

2.4 蛋白質(zhì)和多肽對TGase熱穩(wěn)定性的影響

為了保護(hù)目標(biāo)蛋白在逆境環(huán)境中的穩(wěn)定性，也有研究者曾嘗試將一些保護(hù)性蛋白和多肽添加到目標(biāo)蛋白溶液中，如大豆多肽，谷朊粉，脫脂乳等，這些物質(zhì)在保護(hù)TGase的熱穩(wěn)定性方面均取得了良好的效果[22]。本實(shí)驗(yàn)選用4種物質(zhì)(胰蛋白胨、脫脂乳粉、大豆蛋白、小麥蛋白)進(jìn)行研究。

(A)胰蛋白胨；(B)脫脂乳粉；(C)大豆蛋白；(D)小麥蛋白圖4 蛋白質(zhì)和多肽對TGase t1/2(55 ℃)的影響Fig.4 The effect of proteins and peptide on t1/2(55 ℃) of TGase

由圖4可知，4種物質(zhì)均能改善TGase熱穩(wěn)定性，其中小麥蛋白的影響較為顯著，50 g/L的小麥蛋白使TGase的t1/2達(dá)到135.02 min，較對照提高12.86倍。有學(xué)者認(rèn)為，一些食品蛋白質(zhì)存在分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)(如二硫鍵、酪氨酸的交聯(lián))，將其加入酶液中會(huì)形成類似于保護(hù)膜的網(wǎng)絡(luò)狀空間結(jié)構(gòu)，包裹酶分子，鎖住一定的水分，盡可能地阻止不良環(huán)境對酶活性的破壞[23]。且有些蛋白質(zhì)(如酪蛋白)可能存在有目標(biāo)酶的催化底物，會(huì)在酶的活性中心附近聚集，形成疏水結(jié)構(gòu)，保護(hù)酶的催化活性[17]。此外，小麥蛋白粉中小麥多肽的抗氧化能力也能在一定程度上防止TGase活性中心的巰基被氧化[24]，保護(hù)酶的熱穩(wěn)定性。

2.5 氨基酸對TGase熱穩(wěn)定性的影響

目前，常見的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑除了糖類，多元醇，離子化合物，還有一些氨基酸及其衍生物等[25]。這些小分子物質(zhì)作為分子伴侶，在逆境中維持著蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和功能以阻止蛋白質(zhì)的變性。考慮到不同氨基酸的親水性和疏水性強(qiáng)弱不一，選用了5種氨基酸(精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸)進(jìn)行研究。由于部分氨基酸在磷酸緩沖液中的溶解度較低，我們只研究了10 g/L的各類氨基酸對TGase熱穩(wěn)定性的影響。圖5顯示各類氨基酸對TGase的保護(hù)作用，效果最好的甘氨酸對應(yīng)的TGaset1/2為14.07 min，同比對照提高44.46%。其他4種氨基酸對TGase的保護(hù)性并不明顯，精氨酸的存在還破壞了TGase的熱穩(wěn)定性。研究甘氨酸分子結(jié)構(gòu)可知，甘氨酸的側(cè)鏈?zhǔn)莻€(gè)氫原子，其α-碳上的2個(gè)氫原子賦予分子疏水特性，較小的側(cè)鏈?zhǔn)垢拾彼峥梢蕴钸M(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不能容納別的氨基酸的縫隙里[26]，從而有效維持目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)不被破壞。但與效果較好的糖、鹽、醇類或蛋白質(zhì)影響下的TGase相比，添加氨基酸的TGase的熱穩(wěn)定性并沒有得到明顯地改善，且大部分氨基酸溶解度較差，價(jià)格較為昂貴，不適合在工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。綜合以上因素，不考慮把氨基酸作為正交試驗(yàn)的因素。

圖5 氨基酸類對TGase t1/2(55 ℃)的影響Fig.5 The effects of amino acids on t1/2(55 ℃) of TGase

2.6 復(fù)合穩(wěn)定劑對TGase熱穩(wěn)定性的影響

2.6.1 復(fù)合穩(wěn)定劑的確定

通過對上述的糖類、鹽類、醇類、小麥蛋白和氨基酸進(jìn)行的單因素實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮穩(wěn)定劑的經(jīng)濟(jì)成本以及能否和TGase一起廣泛應(yīng)用于食品、生物等各領(lǐng)域，選取幾個(gè)能明顯改善TGase熱穩(wěn)定性的因素水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，并對結(jié)果進(jìn)行極差分析，以便獲取最佳的穩(wěn)定劑配方。采用L9(34)正交表，以山梨醇(A)、NaCl(B)、葡萄糖(C)、小麥蛋白(D)作為4個(gè)考察因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，見表1和表2。

表1 TGase熱穩(wěn)定劑L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

按表1的正交因素水平設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 TGase熱穩(wěn)定劑L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2的極差分析結(jié)果可以看到，RA>RD>RB>RC，4個(gè)因素對TGase熱穩(wěn)定性的影響大小依次為：山梨醇(A)>小麥蛋白(D)>NaCl(B)>葡萄糖(C)。在這4個(gè)因素中，山梨醇和小麥蛋白的影響較為明顯。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，優(yōu)化TGase熱穩(wěn)定劑最佳組合為A3B3C3D3，即山梨醇50 g/L、小麥蛋白50 g/L、NaCl 50 g/L、葡萄糖50 g/L。對最優(yōu)組合進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，TGase在55 ℃時(shí)的t1/2的平均值為591.49 min，較對照提高59.73倍，高于表2中的每一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，故A3B3C3D3為TGase復(fù)合穩(wěn)定劑的最佳配方。

2.6.2 復(fù)合穩(wěn)定劑對TGase最適反應(yīng)溫度的影響

當(dāng)TGase應(yīng)用于食品生產(chǎn)領(lǐng)域時(shí)，食品的高溫加工工藝會(huì)顯著地破壞TGase的酶活，限制其工業(yè)應(yīng)用范圍。本研究考察了復(fù)合穩(wěn)定劑中TGase的最適反應(yīng)溫度，圖6顯示其最適反應(yīng)溫度為60 ℃，較對照組提高了10 ℃，有效地改善了TGase在高溫加工應(yīng)用中的局限性。

圖6 復(fù)配穩(wěn)定劑中TGase的最適反應(yīng)溫度Fig.6 The optimum reaction temperature of TGase in the best compound stabilizer

2.6.3 復(fù)合穩(wěn)定劑中TGase在不同溫度下的熱穩(wěn)定性

由圖7可知，隨著處理溫度的升高，酶的活力逐漸下降。對照組在40 ℃甚至更高溫度熱處理后，酶活的衰減速率較實(shí)驗(yàn)組下降更為顯著。60 ℃熱處理1h后，對照組的殘余酶活率已降至0，實(shí)驗(yàn)組仍能維持在42.11%，復(fù)合穩(wěn)定劑中的TGase對溫度的耐受性有了較大的改善，有利于延長酶在高溫加工中的應(yīng)用時(shí)間。

圖7 復(fù)配穩(wěn)定劑中TGase在不同溫度下的熱穩(wěn)定性Fig.7 The thermal stability of TGase at different temperatures in the best compound stabilizer

2.6.4 復(fù)合穩(wěn)定劑中TGase的常溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性

成品TGase在常溫儲(chǔ)存期間容易受溫度的影響而逐漸喪失酶活，使其商業(yè)應(yīng)用價(jià)值下降，為此，我們考察了實(shí)驗(yàn)組TGase的常溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性。由圖8可知，隨著時(shí)間的增加，對照組的酶活下降速率明顯快于實(shí)驗(yàn)組。當(dāng)常溫存儲(chǔ)80 d后，對照組的殘余酶活率已下降至11%，而實(shí)驗(yàn)組仍能維持在73.84%，有效地延緩了常溫下酶的失活速率，有利于延長成品TGase的貨架期，維持其商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

圖8 復(fù)配穩(wěn)定劑中TGase的常溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.8 The room temperature storage stability of TGase in the best compound stabilizer

3 結(jié)論

微生物來源的TGase在保存中容易因各種外在因素而發(fā)生酶失活，溫度對酶活的影響更是限制其應(yīng)用范圍的關(guān)鍵因素。相較于分子改造的繁瑣和難以工業(yè)化等問題，外源添加廉價(jià)、安全的穩(wěn)定劑成為酶制劑領(lǐng)域常用的手段。本實(shí)驗(yàn)研究了糖、鹽和多元醇等對TGase熱穩(wěn)定性的影響，并根據(jù)單因素結(jié)果設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，確定復(fù)合穩(wěn)定劑的最佳配方為：山梨醇50 g/L、小麥蛋白50 g/L、NaCl 50 g/L、葡萄糖50 g/L，得到TGase的t1/2為591.49 min，最適反應(yīng)溫度為60 ℃，分別較對照提高了59.73倍和10 ℃，對不同溫度的耐受性也明顯優(yōu)于對照，常溫存儲(chǔ)80 d后的殘余酶活率仍能維持在73.84%。因此，復(fù)配穩(wěn)定劑能較好地改善TGase的熱穩(wěn)定性。目前，諸多的穩(wěn)定劑已被應(yīng)用于各類酶的逆境穩(wěn)定性研究，雖有一定的穩(wěn)定效果但還遠(yuǎn)不能滿足各類工業(yè)應(yīng)用壞境的需求，對新型穩(wěn)定劑的開發(fā)和研究也鮮有報(bào)道?；诖?，研究者們可以研究和篩選新型穩(wěn)定劑對TGase穩(wěn)定性的作用效果，以期能不斷優(yōu)化TGase的穩(wěn)定性。

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