鄭小玲，郭小喜，李曉華，張舸，胡鑫，鄒瓊

（1.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，重慶600020；2.山西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山西太原030024）

隨著人們生活水平的提高，嬰幼兒米粉的品種及需求量日益增大，而嬰幼兒體質(zhì)較差，腸道微生物還原作用較強(qiáng)，易發(fā)生腸原性青紫病，即亞硝酸鹽中毒。硝酸鹽和亞硝酸鹽對(duì)嬰幼兒的危害遠(yuǎn)大于成人[1-4]。在GB 10769-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒谷類(lèi)輔助食品》[5]中規(guī)定嬰幼兒米粉中硝酸鹽（以硝酸鈉計(jì)）殘留量限量為100 mg/kg，亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）殘留量限量為2 mg/kg。鑒于在嬰幼兒米粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的限量較低，且對(duì)嬰幼兒的危害較大，建立靈敏度高和準(zhǔn)確性好的方法，有利于企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程對(duì)于嬰幼兒米粉的質(zhì)量控制和市場(chǎng)產(chǎn)品監(jiān)管檢測(cè)。

在實(shí)際工作中，由于嬰幼兒米粉的特殊性，基質(zhì)成分相對(duì)復(fù)雜，樣品中含有淀粉，極易糊化。GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》[6]適用于食品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測(cè)定，涉及食品種類(lèi)廣泛，但是對(duì)于米粉基質(zhì)并不適用。按GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》的前處理方法在實(shí)際操作中遇到前處理液粘稠不宜過(guò)濾，并且過(guò)濾后濾液渾濁，濾液過(guò)固相萃取小柱非常困難等問(wèn)題。查閱文獻(xiàn)資料，只有采用比色法測(cè)定米粉中亞硝酸鹽的研究[2，4]，比色法靈敏度及重復(fù)性較差，暫無(wú)米粉中硝酸鹽測(cè)定的研究。本方法優(yōu)化了國(guó)標(biāo)中的前處理方法，結(jié)合在線過(guò)濾技術(shù)凈化樣品，解決上述問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)對(duì)嬰幼兒米粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙酮（色譜純）、Ag柱（1 mL）、Na柱（1 mL）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；冰醋酸（色譜純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；碳酸鈉（基準(zhǔn)試劑）：北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司；硝酸鈉標(biāo)液（1 000 mg/L）、亞硝酸鈉標(biāo)液（1 000 mg/L）：美國(guó)阿酷標(biāo)品公司；水為GB/T 6682《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水；C18小柱：美國(guó)色譜科公司，3 mL/500 mg；10 mL注射器：岳陽(yáng)明康醫(yī)用材料有限公司；0.22 μm水性濾膜：天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；市售嬰幼兒配方米粉和跨境電商平臺(tái)抽檢嬰幼兒配方米粉各50份。

1.2 儀器與設(shè)備

離子色譜940：瑞士萬(wàn)通中國(guó)有限公司；MX-F冷凍高速離心機(jī)：德國(guó)西格瑪公司；BS224S電子天平：德國(guó)賽多利斯斯泰帝（上海）貿(mào)易有限公司；KQ-500E超聲儀：昆山舒美公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：德國(guó)默克密理博公司。

1.3 試驗(yàn)過(guò)程

稱(chēng)取均勻試樣4 g，置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加40 mL超純水，搖勻，超聲30 min，取出放置室溫，加入3%乙酸溶液2 mL，混勻。于4℃放置20 min，取出離心 10 000 r/min，15 min。取上清液約 15 mL，C18柱、Ag柱和Na柱，棄去前面7 mL，收集后面洗脫液，通過(guò)0.22 μm水性濾膜針頭過(guò)濾器，進(jìn)樣測(cè)試。固相萃取小柱使用前需活化，C18依次用10 mL甲醇和10 mL超純水通過(guò)，靜置活化30 min。Ag柱和Na柱用10 mL超純水通過(guò)，靜置活化30 min。

1.4 色譜條件

陰離子色譜分析柱為Metrosep A7-250（250 mm×4 mm）；保護(hù)柱 MetrosepASupp4/5Guard（5mm×4mm）；柱溫 45 ℃；進(jìn)樣體積 100 μL，流速為 0.7 mL/min；淋洗液2.5 mmol/L NaCO3+5%丙酮。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

準(zhǔn)確移取亞硝酸根離子（以NO2-計(jì)）標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL和硝酸根離子（以NO3-計(jì)）標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL于1 000 mL容量瓶中，用水稀釋定容，亞硝酸根離子濃度為 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/L，硝酸根離子濃度為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/L。以濃度對(duì)峰面積做曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。試樣加標(biāo)后，平行測(cè)定6次，計(jì)算結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和方法回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 稱(chēng)樣量的選擇

由于嬰幼兒米粉中添加了多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，基質(zhì)復(fù)雜，干擾較多，選擇合適的稱(chēng)量樣對(duì)試驗(yàn)有一定影響。由于實(shí)驗(yàn)室過(guò)程中前處理只是簡(jiǎn)單沉淀蛋白質(zhì)，除去大分子物質(zhì)，主要還得通過(guò)色譜柱分離目標(biāo)物。如果稱(chēng)樣量較大，樣品糊化極為嚴(yán)重，雜質(zhì)干擾目標(biāo)峰。如果稱(chēng)樣量較小，則達(dá)不到檢測(cè)要求的靈敏度。研究考察了 0.5、1.0、2、4、6、8 g 這 6 個(gè)稱(chēng)樣量，對(duì)比不同稱(chēng)樣量樣品的色譜圖，參考峰形、分離度、靈敏度和基線，結(jié)果顯示稱(chēng)樣量4 g效果最佳。

2.1.2 沉淀劑的選擇

通常采用有機(jī)溶劑、酸沉淀、加熱變性和重金屬沉淀等方法去除蛋白質(zhì)。由于嬰幼兒米粉樣品基質(zhì)復(fù)雜，采用有機(jī)溶劑容易在過(guò)C18小柱時(shí)將雜質(zhì)物質(zhì)洗脫。采用加熱變性法不適用于米粉，因?yàn)槊追蹣O易糊化，且沉淀效果較差。采用重金屬沉淀，如常用的乙酸鋅、亞鐵氰化鉀沉淀蛋白質(zhì)，會(huì)引入大量鋅、鉀、鐵離子污染色譜柱，降低離子色譜柱效，影響色譜柱壽命。試驗(yàn)表明，采用3%的乙酸沉淀蛋白質(zhì)效果最佳，雜峰相對(duì)較少。

2.1.3 樣液分離及初步凈化

本方法采用50 mL離心管進(jìn)行沉淀，比國(guó)標(biāo)方法中采用100 mL容量瓶簡(jiǎn)易，方便批量操作。由于米粉含有淀粉，容易糊化，采用濾紙過(guò)濾的方法根本不適用，本方法采用低溫離心分離樣液。上清液依次過(guò)C18柱、Ag柱和Na柱凈化。由于樣品中氯離子含量較高，使用Ag柱出去氯離子，避免過(guò)量的氯離子干擾亞硝酸根的測(cè)定。

2.1.4 在線超濾

嬰幼兒米粉基體復(fù)雜，成分復(fù)雜，除含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)外，還添加了多種食品添加劑。過(guò)固相萃取小柱后的樣液仍不太澄清，稍渾濁。但離子色譜所分析的樣液要求嚴(yán)格，樣品不得含有顆粒物，因?yàn)檫@些顆粒將堵塞并最終損壞分離柱。本方法采用英蘭超濾技術(shù)，即在進(jìn)樣口前加一個(gè)0.22 μm的在線英蘭超濾系統(tǒng)，可以直接處理懸濁液的樣品。該技術(shù)將大分子物質(zhì)、大顆粒物質(zhì)轉(zhuǎn)移，防止其損壞分離柱，堵塞管路。該法采用在線英蘭超濾技術(shù)有效保護(hù)分離柱，并減小干擾，操作簡(jiǎn)單。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 淋洗液的選擇

淋洗液的濃度對(duì)陰離子的分離影響較大，試驗(yàn)比較了Na2CO3和NaHCO3不同濃度的淋洗液。參考文獻(xiàn)的幾種淋洗濃度[7-12]，分別用2.5 mmol/L NaCO3-0.5 mmol/L NaHCO3、3.0 mmol/L NaCO3-0.8 mmol/L NaHCO3、3.2 mmol/L NaCO3-1.0 mmol/L NaHCO3、2.0 mmol/L NaCO3-5%丙酮、2.5 mmol/L NaCO3-5%丙酮、3.0 mmol/L NaCO3-5%丙酮做淋洗液。檢測(cè)同一標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果表明在2.5 mmol/L NaCO3-5%丙酮條件下背景電導(dǎo)率較小，硝酸鹽和亞硝酸鹽的分離效果最好。該法向淋洗液中加入適量丙酮，可有效改善分離效果，與雜質(zhì)峰完全分離。靈敏度高，分析時(shí)間符合要求。故本文選用2.5 mmol/L NaCO3-5%丙酮做淋洗液，待測(cè)組分可完全分離，如圖1~圖4所示。

該法在沉淀蛋白質(zhì)時(shí)引入了乙酸，亞硝酸根和硝酸根離子與其完全分離，不影響檢測(cè)結(jié)果。嬰幼兒米粉基質(zhì)組成復(fù)雜，亞硝酸根和硝酸根離子洗脫后還需要高濃度的40 mmol/L NaCO3-5%丙酮清洗色譜柱。

2.2.2 進(jìn)樣量的選擇

圖1 亞硝酸鹽和硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜分析譜圖Fig.1 The ion chromatogrephy chromatogram of NO2-and NO3-standard sample

圖2 空白試劑色譜圖Fig.2 Blank reagent chromatogram

圖3 米粉樣品色譜圖Fig.3 Baby rice flour sample chromatogram

圖4 米粉樣加標(biāo)色譜圖Fig.4 Baby rice flour spiked sample chromatogram

由于樣品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量通常是痕量的，亞硝酸鹽含量限量為2 mg/kg，對(duì)于儀器的靈敏度要求較高。樣品的進(jìn)樣量對(duì)于色譜的分離有一定的影響。加大進(jìn)樣量可以提高樣品的靈敏度。但是樣品進(jìn)樣量過(guò)大又會(huì)造成色譜柱過(guò)載，雜質(zhì)峰和溶劑峰過(guò)大，影響待測(cè)物質(zhì)的分離效果?？疾炝?5、50、100、200、500 μL這 5種進(jìn)樣量，從分離效果、峰形、峰面積、基線等方面比對(duì)，考察色譜圖，發(fā)現(xiàn)在100 μL的進(jìn)樣量時(shí)，色譜峰峰形較好，對(duì)稱(chēng)性較好，靈敏度高，基線平穩(wěn)，噪音小。

2.3 線性范圍

按1.4所述試驗(yàn)方法配置硝酸根和亞硝酸根離子的混合標(biāo)液。按色譜條件對(duì)混合標(biāo)液進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)硝酸根離子濃度為0.1 mg/L~2.0 mg/L，亞硝酸根離子濃度為0.01 mg/L~0.20 mg/L時(shí)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。以峰面積A（μS×min）對(duì)檢測(cè)組分質(zhì)量濃度Q（mg/L）作線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)（R）如表1所示。

2.4 最低檢出限

以基線噪聲的3倍所相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度計(jì)算，本法測(cè)定硝酸鹽（以NO3-計(jì)）最低檢出濃度為0.2mg/kg，亞硝酸鹽（以NO2-計(jì)）最低檢出濃度為0.1 mg/kg，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的最低檢出濃度。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear equation and correlation coefficient

2.5 方法重現(xiàn)性及回收率

國(guó)內(nèi)外現(xiàn)暫無(wú)米粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的基準(zhǔn)物質(zhì)。本方法選擇3個(gè)添加水平進(jìn)行試樣加標(biāo)回收率試驗(yàn)，以此方法平行測(cè)定6次，對(duì)測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。6次測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和平均回收率結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品加標(biāo)回收率（n=6）Table 2 Recovery rate of standard additions（n=6）

續(xù)表2 樣品加標(biāo)回收率（n=6）Continue table 2 Recovery rate of standard additions（n=6）

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%~2.4%，小于5%，回收率結(jié)果在90.0%~96.0%之間。試驗(yàn)證明，本方法的準(zhǔn)確度和精密度達(dá)到定量分析要求。

2.6 常見(jiàn)陰離子的干擾

在本試驗(yàn)色譜條件下，常見(jiàn)陰離子F-、Cl-、SO42-的保留時(shí)間分別為6.2、8.7、23.1 min。這幾種離子均不干擾硝酸鹽和亞硝酸鹽的測(cè)定。蛋白沉淀劑引入的乙酸也與硝酸根和亞硝酸根離子完全分開(kāi)。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定及回收率

對(duì)重慶市市售和跨境電商的50份的不同品牌的嬰幼兒米粉進(jìn)行監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)，每份樣品測(cè)定3次，回收測(cè)定2次，取平均值，部分結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 15份加標(biāo)硝酸鹽和亞硝酸鹽測(cè)定值和回收率Table 3 NO2-and NO3-value and recovery rate of 15 samples

米粉中亞硝酸鹽（以NO2-計(jì)）濃度為未檢出~0.4mg/kg，硝酸鹽（以 NO3-計(jì)）濃度為 5.2 mg/kg~18.7 mg/kg，這50份米粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量均小于限量標(biāo)準(zhǔn)。亞硝酸鹽回收率為89.5%~96.0%，硝酸鹽回收率為89.8%~96.1%，表明本方法準(zhǔn)確度較高，適用于嬰幼兒米粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測(cè)定。

3 結(jié)論

嬰幼兒是國(guó)家和民族的希望，嬰幼兒米粉的安全備受關(guān)注。嬰幼兒米粉成分復(fù)雜，除含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物之外，還添加多種食品添加劑，如維生素、糖類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽等，本方法采用離心分離樣液，過(guò)柱后采用在線英蘭超濾技術(shù)，解決了樣品前處理液粘稠及過(guò)濾后樣液不澄清等技術(shù)問(wèn)題。結(jié)果表明，本方法高效、靈敏度高、檢出限低、重復(fù)性好等特點(diǎn)，適用于大批量的嬰幼兒米粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測(cè)定，對(duì)嬰幼兒米粉的質(zhì)量控制和政府部門(mén)的安全監(jiān)控具有重大意義。

[1] 王智聰,馮炫,余笑波,等.奶粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽成分分析基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2016,37(21):128-132

[2] 楊琳,許容年,秦志榮,等.嬰兒米粉中亞硝酸鹽測(cè)定前處理方法的改進(jìn)[J].理化檢驗(yàn):化學(xué)分冊(cè),2009,45(7):867-867

[3]李湖中,王素芳,韓軍花,等.《嬰幼兒谷類(lèi)輔助食品》(GB 10769-2010)跟蹤評(píng)估研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2013,25(3):259-264

[4] 丁楊,鄧美榮,孫中華,等.嬰幼兒奶粉及米粉中亞硝酸鹽的檢測(cè)[J].黑龍江醫(yī)學(xué),2016,40(11):1029-1030

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 10769-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒谷類(lèi)輔助食品[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010

[6]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 5009.33-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016

[7] 姚秀娟.英藍(lán)超濾-離子色譜法同時(shí)測(cè)定熟肉制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2015,26(5):360-370

[8] 文君,葉德龍,楊曉松.在線超濾-離子色譜法同時(shí)測(cè)定面粉中3種陰離子[J].理化檢驗(yàn):化學(xué)分冊(cè),2014,50(3):365-367

[9] 徐佳文,雷美康,祝子銅,等.在線超濾-離子色譜法檢測(cè)魚(yú)子醬中的多聚磷酸鹽[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2014,5(9):2753-2756

[10]林高,明陳,梅蘭,等.離子色譜法測(cè)定淀粉中的順丁烯二酸(酐)[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2014,24(5):668-673

[11]沈銀,梅白婕.離子色譜法測(cè)定鹵肉制品中亞硝酸鹽和硝酸鹽[J].肉類(lèi)工業(yè),2016(12):41-43

[12]鐘鶯鶯,陳平,俞雪鈞,等.改進(jìn)的離子色譜法測(cè)定乳制品中亞硝酸鹽和硝酸鹽[J].色譜,2012,30(6):635-640