謝東德 陳江濤 Urbano Monsuy Eyi Rocio Apicante Matesa Maximo Miko Ondo Obono Carlos Sala Ehapo 李瑩 梁雪雁 林敏

1江門市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣東江門529000）；2廣東省援助赤道幾內(nèi)亞醫(yī)療隊(duì)（廣州510000）；3惠州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)中心（廣東惠州516001）；4馬拉博地區(qū)醫(yī)院檢驗(yàn)科（馬拉博，赤道幾內(nèi)亞共和國(guó)）；5汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎教研室（廣東汕頭515000）

瘧疾是一種由瘧原蟲感染引起的嚴(yán)重危害人體的全球性疾病，全世界每年約有1億的臨床病例，約110余萬人死于該病，其中大部分死亡病例發(fā)生在非洲撒哈拉沙漠以南地區(qū)［1］。眾所周知，與其他的許多感染性疾病一樣，自身的遺傳因素能夠影響人體對(duì)于瘧疾感染的風(fēng)險(xiǎn)。人類血小板因子Ⅳ（PF4）能夠活化血小板，使血小板與紅細(xì)胞表面的Duffy抗原結(jié)合，從而殺傷紅細(xì)胞里面的瘧原蟲［2-3］，達(dá)到降低宿主腦型瘧的風(fēng)險(xiǎn)的作用［4-5］。筆者在參加援非醫(yī)療隊(duì)期間工作于赤道幾內(nèi)亞共和國(guó)馬拉博地區(qū)醫(yī)院，對(duì)許多疑似瘧疾患者作過瘧原蟲檢查，同時(shí)對(duì)部分瘧疾患者作過PF4檢測(cè)，旨在探討瘧原蟲感染與PF4的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域 比奧科島（Bioko Island），原名“費(fèi)爾南多波島”（Fernando Poo），是非洲幾內(nèi)亞灣中最大的一個(gè)火山島，屬赤道幾內(nèi)亞管轄，隔海與尼日利亞和喀麥隆相望。該島面積為2 017平方公里，島上最高點(diǎn)3 012 m，人口約266 000萬人，屬于潮濕的熱帶雨林氣候，是全球瘧疾感染最嚴(yán)重的地區(qū)之一。盡管赤道幾內(nèi)亞政府在該島實(shí)施瘧疾防治計(jì)劃（Bioko Island Malaria Control Project，BIMCP），以中國(guó)為代表的國(guó)際社會(huì)派遣醫(yī)療隊(duì)參與了當(dāng)?shù)氐寞懠卜揽匾呀?jīng)取得明顯的效果，但瘧疾仍然是該島的一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題。該島的昆蟲學(xué)接種率（entomological inoculation rates，EIRs）為163 ～ 830，戶外EIRs超過900，超過52%的感染者為5歲以下的兒童［6］。

1.2 研究對(duì)象 本研究開展于2012-2014年筆者參與廣東省援助赤道幾內(nèi)亞醫(yī)療隊(duì)期間，所有計(jì)劃獲得赤道幾內(nèi)亞馬拉博地區(qū)醫(yī)院（Malabo Re?gional Hospital）倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并同時(shí)取得患者/監(jiān)護(hù)人的知情同意。隨機(jī)抽取2013年雨季（當(dāng)?shù)丿懠沧顬閲?yán)重時(shí)間段）門診患者，按照瘧疾的感染情況將研究對(duì)象分為兩組：（1）瘧疾組：馬拉博地區(qū)醫(yī)院收治的瘧原蟲感染者（黑人），共122例，其中男66例，女58例，年齡在2～63歲之間，平均（26.3±5.6）歲；（2）正常對(duì)照組：無近期病史的人，共399例，其中男189例，女210例，年齡在2～74歲之間，平均（23.5±4.7）歲。

1.3 樣本采集 采用無抗凝劑真空管采集每名收試者靜脈血3 mL，同時(shí)按照國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制備薄血膜和厚血膜［7］。其次，將3 mL靜脈血靜置凝固后，在2 h內(nèi)采用3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min分離血清，并將血清置于1.5 mL離心管-20℃冷凍保存待用。

1.4 瘧原蟲檢測(cè)及蟲種鑒定 采用WHO推薦的白細(xì)胞瘧原蟲計(jì)數(shù)法，在油鏡下對(duì)吉姆沙染色后血涂片進(jìn)行鏡檢［8］；按照本實(shí)驗(yàn)室以往建立定量PCR及熔解曲線的方法進(jìn)行蟲種鑒定，同時(shí)以四種瘧原蟲（間日瘧原蟲，Plasmodium vivax；三日瘧原蟲，Plasmodium malariae；卵形瘧原蟲，Plasmodium ovale；惡性瘧原蟲，Plasmodium falciparum）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為對(duì)參照物［9］。

1.5 PF4濃度檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)，試劑系美國(guó)R&D的人類血小板因子4（PF?4/CXCL?4）ELISA檢測(cè)試劑盒，全程嚴(yán)格按照試劑使用說明書進(jìn)行操作。大致步驟是：（1）分離出患者的血清標(biāo)本；（2）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣及患者標(biāo)本加樣等酶標(biāo)檢測(cè)操作；（3）在酶標(biāo)儀以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依順序測(cè)定各孔的吸光度（OD值）；（4）以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)患者標(biāo)本的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的PF4濃度；（5）以PF4標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時(shí)的OD值為界定值用以確定患者及獻(xiàn)血者的PF4水平屬于陰性還是陽性，筆者擬定≤0時(shí)的OD值為陰性、＞0時(shí)的OD值為陽性。PF4濃度單位為μg/L。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用IBM@SPSS Statistics Version 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。用頻數(shù)分布曲線來檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，若偏度系數(shù)（Skew?ness）和峰度系數(shù)（Kurtosis）均＜ 1，可認(rèn)為近似于正態(tài)分布；若Skewness和Kurtosis均＞1，即認(rèn)為數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)（P25～P75）來描述。采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann?WhitneyU）比較瘧疾組與對(duì)照組的PF4水平。用非條件的Logistic回歸進(jìn)行單因素和多因素分析。比值比（OR）和調(diào)整OR（AOR）用95%的置信區(qū)間表示（95%CI），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘧疾感染情況 所有樣本用WHO法和熒光定量PCR?熔解曲線分析，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致該地區(qū)瘧疾均是惡性瘧原蟲，瘧原蟲密度不符合正態(tài)分布：21 335（4 065 ～ 91 800）個(gè)/μL，（Skewness=2.755和Kurtosis=8.266均＞1）。如表1所見，年齡是人群的瘧疾感染瘧疾感染的強(qiáng)烈的相關(guān)因素，其中兒童組和少年組的瘧疾感染率均高于成人組的感染率，兩者與成人組比較，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，表1）。但不同性別的比較，兩者之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 不同年齡和性別的瘧疾感染風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)估Tab.1 Risk assessment of malaria infection at different age and sex 例

2.2 瘧疾組與對(duì)照組PF4均值和PF4陽性率比較 如表2所示，PF4水平在瘧疾組與對(duì)照組均不符合正態(tài)分布，瘧疾組略高于對(duì)照組，經(jīng)兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann?WhitneyU），發(fā)現(xiàn)Z=-2.07，P=0.038，兩者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

根據(jù)PF4的參考范圍，將瘧疾陽性組劃分為High組（PF4水平高于正常）和Normal組（PF4水平處于正常范圍）。我們發(fā)現(xiàn)，兩組的瘧原蟲密度基本處于同一范圍，結(jié)果如圖1所示，兩者之間無存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.657）。

表2 2組PF4均值和PF4陽性率比較Tab.2 Comparison of PF4 mean and PF4 positive rate between 2 groups

圖1 PF4水平和瘧原蟲密度圖Fig.1 PF4 levels and Plasmodium density maps

3 討論

在非洲許多國(guó)家，瘧疾被稱為“頭號(hào)殺手”［10］。赤道幾內(nèi)亞共和國(guó)位于非洲中西部，是全球50個(gè)最不發(fā)達(dá)國(guó)家之一，屬熱帶雨林氣候，國(guó)家的衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)條件差，為瘧疾的高發(fā)區(qū)，其中兒童瘧疾占相當(dāng)大比例，而兒童瘧疾病例以惡性瘧原蟲感染為主，尤其是＜5歲兒童感染瘧疾的死亡率高［11］。由于大部分抗瘧藥物逐漸出現(xiàn)的耐藥性以及開發(fā)有效疫苗是一個(gè)長(zhǎng)期過程，因此研究瘧疾的發(fā)病機(jī)制以及宿主對(duì)感染作出的反應(yīng)顯得尤為緊迫。

血漿PF4增高表示血小板被激活及其釋放反應(yīng)亢進(jìn)，常見于血栓前狀態(tài)和血栓栓塞性疾病。因此，盧亞敏等［12］研究揭示冠心病患者PF4水平較正常組升高，膽固醇水平可能通過影響PF4的水平促進(jìn)冠心病的發(fā)生，且與冠心病病情程度相關(guān)。MCMORRAN等［2］認(rèn)為PF4激活血小板后，可使血小板與紅細(xì)胞表面的Duffy抗原相結(jié)合，通過結(jié)合感染的細(xì)胞及殺死其內(nèi)部的寄生蟲來限制紅細(xì)胞內(nèi)的瘧原蟲的繁殖。最近很多研究也顯示PF4、紅細(xì)胞表達(dá)的Duffy抗原、抗瘧素因子在血小板殺死瘧原蟲能力中發(fā)揮重要作用［13］。與1983年Essien EM和Ebhota MI在尼日利亞的研究一致［14］，本研究發(fā)現(xiàn)，瘧疾組的PF4水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），揭示人體感染瘧原蟲后，血液中的PF4水平可應(yīng)激性升高，通過與感染的紅細(xì)胞結(jié)合來殺死其內(nèi)的瘧原蟲。而PF4和紅細(xì)胞Duffy抗原受體（Fy）結(jié)合是血小板殺死瘧原蟲的關(guān)鍵。PF4與感染的紅細(xì)胞接觸后，必須依賴與之結(jié)合的Fy受體，定位于紅細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲的消化泡（DV）并導(dǎo)致細(xì)胞器的特定溶解和瘧原蟲的死亡，由此可見PF4是一個(gè)獨(dú)特的例子，它是一種由宿主衍生能直接殺滅原蟲的趨化因子。但令人困惑的是，我們的實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)PF4高水平組和正常水平組之間的惡性瘧原蟲密度的存在差異，可能與受感染紅細(xì)胞表達(dá)的Duffy抗原受體（Fy）的數(shù)量有關(guān)，PF4與Fy復(fù)合物如何定位瘧原蟲以及進(jìn)入瘧原蟲的復(fù)雜分子機(jī)制亦還有待證明。由于未有更詳細(xì)的相關(guān)研究報(bào)道，這有待于我們?nèi)ヒ贿M(jìn)步擴(kuò)大標(biāo)本的數(shù)量，以期找到一個(gè)更有說服力的結(jié)果。

該研究的目的是為了了解血小板介導(dǎo)的瘧原蟲殺滅機(jī)制，為瘧疾治療提供思路。前人的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血小板在抵抗瘧原蟲過程中起到了一定的作用，本次研究拓展了前人的研究，進(jìn)一步探索PF4和Fy等關(guān)鍵物質(zhì)在該過程中發(fā)揮的作用。

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