戴燕 金世光 王薛潔 楊鑫泉 王大新

江蘇省蘇北人民醫(yī)院 1醫(yī)學實驗研究中心，2急診科（江蘇揚州 225001）

卵巢惡性腫瘤的發(fā)生率及病死率有明顯增長趨勢，其預后差、致死率高［1-4］。卵巢癌細胞中促生長因子TGF?β、EGF與其受體在卵巢癌中過表達并能激活下游信號通路，是癌細胞發(fā)生EMT的重要信號，促進癌細胞侵襲轉移［5-6］。有文獻報道RNA結合蛋白Larp1在上皮性腫瘤細胞中對mTOR mRNA的翻譯起始有重要調控作用。同時發(fā)現(xiàn)敲除Larp1蛋白能明顯抑制宮頸癌HeLa細胞的侵襲轉移，因此推測Larp1表達與腫瘤發(fā)展及預后關系密切［7-10］。Larp1 可與 PABP、啟動子elF4E形成聚合體，同時能與前多聚核糖體亞基60S和80S結合，在RNA轉錄翻譯過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。在前期研究基礎上，本文擬通過檢測卵巢癌細胞中Larp1與促生長因子對Larp1表達的影響，進一步探討Larp1對EMT轉化與卵巢癌細胞侵襲轉移能力的作用，將為診斷治療卵巢癌提供新的生物標記與治療方向。

1 材料與方法

1.1 試劑與抗體 10%胎牛血清RPMI?1640培養(yǎng)液（Sigma?Aldrich）。Western Blotting實驗使用抗體Larp1（Strategic Diagnostic）與 β ?tubulin（Sigma?Al?drich），二抗 Anti?rabbit?HRP（Glostrup）、Anti?rat?HRP（Santa Cruz），稀釋比例均為1∶5 000。免疫熒光染色實驗中Larp1抗體稀釋比例為1∶100，Alexa?Fluor 488（Invitrogen）稀釋比例為1∶500。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 卵巢癌細胞培養(yǎng)于RPMI?1640培養(yǎng)基（含有10%FCS）（Invitrogen）并放置于5%CO2/37℃孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 構建DNA質粒載體 GFP?Larp1從OriGene（Rockville）購入，pCDNA/GW?53/CAT（Invitrogen）在后續(xù)轉染實驗中作為空載體質粒組。Gateway T?RexTM的表達體系用于構建穩(wěn)定轉染Larp1過表達的SKOV?3細胞。Larp1基因成功克隆至pT?RExTM?DEST?30（Invitrogen）。

1.2.3 Larp1在卵巢癌細胞中的表達水平檢測 細胞溶解于裂解液后用PBS清洗兩次，加入200 μL裂解液，4℃離心10 min。通過BCA法（Thermo Scientific）確定濃度并稀釋后使用SDS?PAGE電泳法分離并轉膜（BioRad），接著在5%的脫脂牛奶（溶于 0.05%PBS?T）（Sigma?Aldrich）恒溫封閉1 h（37℃）；加入一抗4℃孵育過夜；PBS?T漂洗3次，每次5 min；加二抗后37 ℃孵育2 h，PBS?T漂洗3次，每次5 min；ECL（Millipore）顯影，暗室壓片。

1.2.4 細胞轉染含有GFP?Larp1的DNA質粒 SKOV?3與OVCAR?3細胞匯合率達90%時轉移至6孔板，LipofectamineTM（Invitrogen）或者Effectene?（Qiagen）為溶劑。OVCAR?3分別轉染0.5、1、2 μg DNA（GFP?Larp1）質粒，未轉染細胞為對照組。另外SKOV?3細胞也如上轉染1與 2 μg DNA（GFP?Larp1）質粒，或者轉染0.5、1 、2 μg DNA（pT?REx?Larp1），轉染24 h后獲得細胞裂解物。

1.2.5 免疫熒光染色 在六孔板中放置蓋玻片并培養(yǎng)SKOV?3細胞，接著室溫下加入PHEM固定10 min后加入PBSTB封閉1 h，再加入一抗孵育過夜。細胞經過兩次PBS清洗后，加入Alexa Fluor?488（Invitrogen）孵育1 h，再PBS漂洗3次后封片。

1.2.6 激光共聚焦顯微鏡 蛋白樣品熒光染色后通過激光共聚焦顯微鏡（Leica Microsystems）觀察并獲取圖像，ImageJ軟件處理圖像（NIH）。

1.2.7 3D趨化侵襲實驗 TGF?β（Invitrogen）、bF?GF（Invitrogen）、EGF（Promega）、PBS 加入MatrigelTM。液狀MatrigelTM（40 μL）加入Chamber Slides在37 ℃下聚合20 min。GFP?Larp1轉染與對照組細胞轉染過夜后培養(yǎng)于100 mm培養(yǎng)皿中（5×103細胞）。4 h后更換為降血清培養(yǎng)液。MatrigelTM侵襲細胞15 min后固定并染色（轉染48 h后），GFP?Larp1表達細胞與空載體質粒轉染細胞由AlexaFluor?568和Alexa Fluor?488染色，其余步驟均按照之前所述重復。

1.2.8 定點趨化侵襲實驗 在液狀MatrigelTM（BD）基底膜內分別加入TGF?β（0.3 ng/μL）、EGF（3 ng/μL）、bFGF（3 ng/μL）、PBS（對 照 組）。MatrigelTM在37 ℃下聚合15 min，OVCAR?3與SKOV?3細胞轉染過夜后轉移至100 mm培養(yǎng)皿中（7×105細胞），轉染48 h后觀察侵襲細胞數(shù)量（Nikon）。

1.3 數(shù)據(jù)分析 應用GraphPad Prism 4.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。P≤0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 Larp1蛋白在各卵巢癌細胞株內的表達與分布Fig.1 The localization and endogenous expression of Larp1 in ovarian cancer cells

2 結果

2.1 Larp1在OVCAR?3與SKOV?3內表達水平最低且分布于細胞核內 Western Blot結果顯示SKOV?3與OVCAR?3的Larp1蛋白表達水平相對較低（圖1A），因此選取OVCAR?3與SKOV?3進行轉染實驗。另外免疫熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)Larp1主要集中分布于SKOV?3細胞核內（圖1B）。

2.2 在OVCAR?3與SKOV?3內轉染GFP?Larp1質粒使其過表達 如圖2A所示，在使用10%SDS?PGGE分離蛋白時Larp1與GFP?Larp1（150 kDa）較難區(qū)分，因此進一步用8%SDS?PGGE分離蛋白。當 0.5 μg DNA轉染到OVCAR?3細胞且DNA與LipofectamineTM轉染濃度比為1∶1.5時，轉染效果最優(yōu)（圖2B）。SKOV?3細胞中轉染2 μg DNA 且比例為1∶2時，GFP?Larp1表達量最高（圖2C）。當2 μg DNA：Effectene?溶劑為1∶1.25時，轉染結果最理想，沿用此比例進行后續(xù)實驗（圖2D）。

圖2 優(yōu)化GFP?Larp1 DNA質粒轉染濃度Fig.2 Transfection optimisation for Larp1 DNA constructs

圖3 OVCAR?3細胞在3D侵襲實驗中形態(tài)變化Fig.3 OVCAR?3 cells in 3D invasion

2.3 通過3D細胞侵襲法檢測Larp?1胞內定位與分布 研究結果顯示在MatrigelTM中加入誘導EMT的促生長因子，OVCAR?3細胞通常位于MatrigelTM表面，且未發(fā)現(xiàn)明顯突觸伸入基底膜膠。而相比于沒有生成突觸的細胞，那些生成伸入基底膜膠突觸的細胞或者已經大部分嵌入基底膜膠的細胞呈近圓形（圖3A、C）。在促生長因子與PBS誘導下，轉移的腫瘤細胞易聚集且有些表現(xiàn)為成纖維細胞形態(tài)（圖4A）。此外，Larp1在轉染細胞內位于細胞質內，而在空載體轉染細胞內（PBS干預）Larp1分布在細胞核內（圖4B）。轉染GFP?Larp1的SKOV?3細胞在TGF?β/MatrigelTM內侵入基底膜最深，集體遷移現(xiàn)象最明顯，細胞內Larp1表達水平最高，細胞內均生成長肌動蛋白突觸，深入MatrigelTM內同時Larp1與圓形突觸共定位（圖4C、D）。

2.4 Larp1蛋白過表達會提高OVCAR?3與SKOV?3細胞侵襲能力 本研究采用定點趨化實驗來檢測GFP?Larp1過表達與空載體轉染的OVCAR?3與SKOV?3細胞對基底膜膠的侵襲能力差異，發(fā)現(xiàn)隨著位置的外移降低濃度，細胞會向濃度高的中間位置侵襲（圖5A），同時20×物鏡觀察GFP?Larp1轉染細胞（圖5B）。從細胞對基底膜膠的不同扭曲程度可以推論SKOV?3比OVCAR?3細胞侵略性更強（圖5C）。另外結果顯示在PBS中，GFP?Larp1過表達細胞與對照組細胞相比趨化侵襲反應無明顯區(qū)別。而在bFGF干預下，OVCAR?3細胞過表達Larp1后趨化侵襲現(xiàn)象十分明顯，其他未轉染的細胞趨化侵襲數(shù)量在bFGF、EGF、TGF?β環(huán)境下并未表現(xiàn)出明顯區(qū)別（圖5C與D）。此外，轉染GFP?Larp1的SKOV?3細胞對bFGF的趨化侵襲比轉染空載體質粒細胞更明顯（P=0.07）（圖5D）。

圖4 SKOV?3細胞在3D侵襲實驗中形態(tài)變化Fig.4 SKOV?3 cells in 3D invasion

圖5 定點趨化侵襲檢測Fig5 Spot chemoinvasion assay

3 討論

卵巢癌細胞的侵襲和轉移是卵巢癌致死率居高不下的主要原因，Larp1表達上調后對上皮性腫瘤細胞的EMT及侵襲轉移有正調控作用［8，12］。為了進一步探討Larp1在卵巢腫瘤侵襲轉移機制中的作用，本研究首先通過3D侵襲實驗發(fā)現(xiàn)OVCAR?3細胞內GFP?Larp1與Larp1在細胞邊緣形成泡狀肌動蛋白突觸，而SKOV?3細胞在TGF?β/MatrigelTM中有應力纖維生成并與Larp1共定位。同時GFP?Larp1高表達的SKOV?3細胞內肌動蛋白突觸高度集中并延展，突觸形成最多。這些突觸與板狀偽足形成、附著底層等過程都有直接關系，Larp1與突觸共定位證明Larp1過表達對細胞侵襲轉移能力的增強有重要作用。最后定點趨化侵襲實驗結果顯示轉染Larp1的OVCAR?3與SKOV?3細胞對促生長因子的趨化侵襲現(xiàn)象比對照組更明顯，推測Larp1與促生長因子可能通過相互作用促進EMT并增強細胞侵襲轉移能力。綜上所述Larp1過表達能通過與促生長因子間的相互作用來促進細胞EMT轉化，同時促進肌動蛋白突觸形成增強卵巢惡性腫瘤的侵襲轉移能力，但其具體分子機制尚不明確，仍需進一步體內體外實驗來闡明，這將為卵巢腫瘤的侵襲轉移提供新的生物標記與治療方向。

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