尹利方，陳澤斌，夏體淵，王定康，姚麗媛，華金珠，徐勝光，王家銀

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214; 3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南 昆明 650205)

表1 所用PCR引物

【研究意義】隨著中國工業(yè)和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，城市污水的入湖量不斷增加，河口和近岸海域氮磷負(fù)荷逐年增加，近岸水質(zhì)持續(xù)下降，富營養(yǎng)化問題日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致了一系列的環(huán)境問題，如頻繁的赤潮和水華。滇池是中國著名的高原淡水湖泊，水污染嚴(yán)重，氮磷有機(jī)污染嚴(yán)重超標(biāo)，水質(zhì)為V類水體，嚴(yán)重富營養(yǎng)化?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在過去幾十年里，圍繞滇池開展的研究多為非點(diǎn)源污染控制、地球化學(xué)和生態(tài)學(xué)方面，而水體和沉積物中微生物的研究十分匱乏。甲烷(CH4)是產(chǎn)甲烷菌在厭氧條件下分解有機(jī)物產(chǎn)生的溫室氣體，它對全球變暖的貢獻(xiàn)僅次于二氧化碳[1]。20世紀(jì)80年代以來，甲烷的溫室效應(yīng)已達(dá)20 %，并以每年0.8 %～1 %的速度增長，在溫室效應(yīng)中起著越來越重要的作用[2]。目前對湖泊甲烷釋放總量的研究主要集中在源和匯上，在低溫下，大型淡水湖泊是大氣CH4的來源，來源于沉積物中的產(chǎn)甲烷古菌，它在厭氧條件下產(chǎn)生和釋放甲烷[3]。因此，為全面了解甲烷排放的來源。有必要研究湖泊沉積物中甲烷菌群落結(jié)構(gòu)，為湖泊沉積物CH4排放的準(zhǔn)確估算提供數(shù)據(jù)支持。反硝化作用在水體氮循環(huán)系統(tǒng)中起著重要作用。在此過程中，反硝化細(xì)菌受到缺氧外部條件的影響，將硝酸鹽或亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氮?dú)饣蛞谎趸⑵溽尫诺酱髿庵?，減少了水體中氮元素?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】因此，對滇池沉積物中反硝化細(xì)菌的多樣性進(jìn)行研究，可為微生物對反硝化作用的調(diào)控、反硝化作用的時(shí)空耦合效應(yīng)和區(qū)域氮素生物地球化學(xué)循環(huán)模式的建立提供理論依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】文章以滇池沉積物為研究對象，采用克隆文庫的分子克隆方法，研究產(chǎn)甲烷菌和反硝化菌的群落結(jié)構(gòu)，從而使人們對滇池富營養(yǎng)化和甲烷排放的機(jī)制有更全面的認(rèn)識，為滇池水體修復(fù)提供生物學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

沉積物樣品DC6于2017年1月采集自滇池草海，采用抓斗式底泥采樣器在緯度N24°55′59″，經(jīng)度E102°41′8″位點(diǎn)分別進(jìn)行3次重復(fù)采樣，重復(fù)之間間隔10 m，重復(fù)樣品混勻后裝入滅菌的250 mL錐形瓶，用于總DNA的提取。

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

按陳澤斌等[4]的方法提取沉積物總DNA，采用引物NirS1F / NirS6R和Me1 / Me2分別對沉積物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)，得到反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段。PCR反應(yīng)體系及條件參照周麗[5]和楊秀清[6]的文獻(xiàn)，取5 μl PCR產(chǎn)物，用1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3 克隆與測序

回收PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體(TaKaRa)，按載體說明書進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。用菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆(PCR反應(yīng)體系和條件同1.2)，陽性克隆測序委托上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.4 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

使用Mothur軟件按相似性(>97 %)將測得序列劃分為不同操作分類單元(OTU)并計(jì)算文庫的覆蓋率(C)[7]；用BLASTN程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中完成序列比對[8]；用MEGA軟件生成序列系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段的電泳檢測

用表1列出的引物對反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(圖1)，分別得到長度分別為1000和760 bp的單一片段，這與周麗[5]和楊秀清[6]的報(bào)道一致。反硝化細(xì)菌特異性片段濃度較低，低于50 ng/μl，產(chǎn)甲烷菌特異性片段濃度較高，高于100 ng/μl。試驗(yàn)證實(shí)了滇池沉積物中存在反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌，且產(chǎn)甲烷菌的豐度高于反硝化細(xì)菌。

2.2 克隆文庫評價(jià)

分別在2個(gè)克隆文庫中隨機(jī)挑取100個(gè)菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，獲得的陽性克隆子數(shù)分別為55和99個(gè)(表2)，說明反硝化細(xì)菌克隆文庫中克隆子陽性率偏低，約為55.00 %，這可能與2.1中PCR擴(kuò)增得到的反硝化細(xì)菌特異性片段的濃度較低有關(guān)，導(dǎo)致其與pMD19-T載體連接率低，大量空載體被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌；2.1中PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)甲烷菌特異性片段的濃度高(>100 ng/μl)，其克隆文庫的陽性率也高，約為99.00 %。Mothur軟件按大于97 %的相似性將2個(gè)克隆文庫的測得序列分別劃分為10個(gè)和5個(gè)OUT(表2)，說明盡管反硝化細(xì)菌的豐度低于產(chǎn)甲烷菌，但物種多樣性高于產(chǎn)甲烷菌。2個(gè)文庫的覆蓋率分別為81.82 %和94.95 %(表2)，均大于80 %，說明構(gòu)建的2個(gè)文庫有效，測序深度適宜，可以代表沉積物中反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的物種多樣性。

a:反硝化細(xì)菌特異性片段電泳圖；b:產(chǎn)甲烷菌特異性片段電泳圖；M:5 μl DL2000 DNA Marker；1、2、3-泳道a:Specific fragment electrophoresis of denitrifying bacteria; b:Specific fragment electrophoresis map of methanogenic bacteria; M:5 μl DL2000 DNA Marker; 1,2,3:Lane圖1 反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段電泳Fig.1 Specific fragment electrophoresis of denitrifying bacteria and methanogenic bacteria

2.3 反硝化細(xì)菌克隆文庫中代表序列的BLASTN比對結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

結(jié)合MEGA軟件生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，以及Mothur軟件劃分OTU的結(jié)果(表3)，從55個(gè)陽性克隆子中選出10個(gè)代表序列(圖2)，并運(yùn)用BLASTN程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)55個(gè)陽性克隆子可分為10個(gè)種類：OTU1(代表序列為1-6-1，占比1.82 %)類序列與從污泥中一株未培養(yǎng)細(xì)菌CYCU的以亞硝酸鹽還原酶基因序列相似性達(dá)91 %[10]，說明該類菌株具有反硝化活性，但其分類地位未能準(zhǔn)確鑒定；OTU2(1-6-22，1.82 %)類序列與Pandoraeafaecigallinarum的相似性達(dá)94 %；OTU3(1-6-20，1.82 %)類序列與水稻土中對異化鐵還原反應(yīng)的貢獻(xiàn)最大的優(yōu)勢菌群Geoalkalibactersubterraneus的相似性達(dá)81 %[11]，是潛在的未知種類；OTU4(1-6-33，10.91 %)類序列與廢水活性污泥細(xì)菌Steroidobacterdenitrificans的相似性達(dá)82 %[12]；OTU5(1-6-15，1.82)類序列與有光異養(yǎng)制氫特性的細(xì)菌Rubrivivaxgelatinosus相似性達(dá)80 %[13]；OTU6(1-6-27，7.28 %)類序列與Azoarcussp.的相似性達(dá)80 %；OTU7(1-6-38，7.28 %)類序列與Polymorphumgilvum的相似性達(dá)81 %；OTU8(1-6-41，10.91 %)類序列與Sulfuritaleahydrogenivorans的相似性達(dá)79 %；OTU9(1-6-84，3.64 %)類序列與具有甲苯降解特性的Thauerasp.相似性達(dá)82 %[14]；OTU10(1-6-4，52.73)類序列與污水處理廠尾水中細(xì)菌Dechloromonasaromatica的相似性達(dá)86 %[15]，該類群是反硝化細(xì)菌中的優(yōu)勢類群；OTU1、OTU2、OTU3、OTU5、OTU9類序列的發(fā)現(xiàn)頻率較低，為反硝化細(xì)菌中的低豐度類群。

表2 反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段克隆文庫分析

表3 反硝化細(xì)菌特異性片段克隆文庫中各OUT代表序列分析

粗體和下劃線標(biāo)記的序列為代表序列，下同Bold and underlined sequences were representative sequences. The same as below圖2 反硝化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of denitrifying bacteria

2.4 產(chǎn)甲烷菌克隆文庫中代表序列的BLASTN比對結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

結(jié)合MEGA軟件生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，以及Mothur軟件劃分OTU的結(jié)果(表4)，從99個(gè)陽性克隆子中選出5個(gè)代表序列(圖3)，并運(yùn)用BLASTN程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)99個(gè)陽性克隆子可分為5個(gè)種類：OTU1(I073，1.01 %)類序列與水稻土及污泥中大量存在的Methanobacteriumoryzae相似性達(dá)85 %[16]；OTU2(H10，1.01 %)類序列與利用氫和甲酸的產(chǎn)甲烷菌甲酸甲烷桿菌(Methanobacteriumformicicum)相似性達(dá)85 %[17]；OTU3(E12，3.03 %)類序列與酸性泥炭沼澤中大量存在的CandidatusMethanoregulaboonei相似性達(dá)85 %[18]；OTU4(E07，3.03 %)類序列與采油廢水中檢測到的Methanolineatarda相似性達(dá)86 %。OTU5(H012, 91.92 %)類序列與甲酸甲烷規(guī)則菌(Methanoregulaformicicum)相似性達(dá)86 %，該類群是反硝化細(xì)菌中的優(yōu)勢類群，該類群也是最早被報(bào)道的產(chǎn)甲烷微生物；OTU1、OTU2為反硝化細(xì)菌中的低豐度類群。

表4 產(chǎn)甲烷菌特異性片段克隆文庫中各OUT代表序列分析

圖3 反硝化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of denitrifying bacteria

3 討 論

本研究測得的154條克隆子序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知可培養(yǎng)菌株的相似性在79 %～94 %，98.7 %的序列與可培養(yǎng)菌株的相似性低于90 %，說明滇池沉積物中的反硝化細(xì)菌與產(chǎn)甲烷菌多為潛在的未被培養(yǎng)的新種，相似的可培養(yǎng)群落多來自于污泥、水稻土、廢水和沼澤，這與前人的研究報(bào)道一致。

研究得到的反硝化細(xì)菌序列全部歸屬于Proteobacteria門，這與大量反硝化菌屬于Betaproteobacteria綱的報(bào)道相符合[19]。與文庫中序列相似的可培養(yǎng)微生物屬于Pandoraea屬(1.82 %)、Thauera屬(3.64 %)、Geoalkalibacter屬(1.82 %)、Steroidobacter屬(1.82 %)、Rubrivivax屬(1.82 %)、Azoarcus屬(7.28 %)和Polymorphumgilvum屬等，在以往的研究中，這些屬也作為反硝化細(xì)菌被報(bào)道[20]。

在《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第九版中，產(chǎn)甲烷菌的分類包括甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)共5個(gè)目，本研究得到的所有序列都?xì)w屬于甲烷桿菌目，未檢測到其他目的產(chǎn)甲烷菌種類。據(jù)報(bào)道，甲烷桿菌目微生物能以H2、CO2、甲酸鹽和甲醇為代謝底物，產(chǎn)生甲烷[21]。本研究發(fā)現(xiàn)的Methanoregula屬微生物被報(bào)道是泥炭蘚濕地土壤中優(yōu)勢的產(chǎn)甲烷菌類群[22]。

本試驗(yàn)中，通過對目的片段的克隆得到了啟示：通過PCR獲得的目的片段如果要克隆到載體上，連接體系中目的片段的濃度必須要達(dá)到要求。例如反硝化細(xì)菌特異性片段濃度過低導(dǎo)致其與pMD19-T載體連接率低，大量空載體被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，文庫中克隆子陽性率偏低。相反，產(chǎn)甲烷菌特異性片段的濃度高(>100 ng/μl)，其克隆文庫的陽性率也高，約為99.00 %。

本研究只采用引物Me1/Me2對產(chǎn)甲烷菌的多樣性進(jìn)行研究，尚且存在不足。Banning[23]和Juottonen[24]等人研究指出，Mcr引物和Me引物在檢測產(chǎn)甲烷菌檢測中具有不同的靈敏度。Me引物無法檢測到產(chǎn)甲烷菌中的Methanosaetaceae和Methanobacteriaceae類群，導(dǎo)致研究結(jié)果不能覆蓋全部物種，這與本研究的結(jié)果一致。因此，為了全面準(zhǔn)確的評估環(huán)境中的產(chǎn)甲烷菌的多樣性，需要選用多對引物進(jìn)行研究，其次，還應(yīng)結(jié)合傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，生理生化鑒定方法，才能得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

4 結(jié) 論

隨著厭氧培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的群體研究會更加詳細(xì)和全面。今后的相關(guān)研究可以集中在以下2個(gè)方面：首先，可以通過改進(jìn)微生物分類技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多的產(chǎn)甲烷菌群；其次，對產(chǎn)甲烷菌的代謝特征進(jìn)行更詳細(xì)的研究，為環(huán)境治理和生物能源開發(fā)提供理論依據(jù)。

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