張保榮

畢茹茹

顧 兵

(1徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2 宿遷市第一人民醫(yī)院，江蘇 宿遷 223899；3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221002)

腸桿菌科細菌是醫(yī)院和社區(qū)感染最常見的病原菌，可引起多部位炎癥，如肺炎、泌尿系統(tǒng)炎癥、敗血癥、腹膜炎、醫(yī)療器械相關(guān)性感染等。由于幾乎可水解所有頭孢菌素的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)在腸桿菌科細菌中的流行，對于重癥感染患者，碳青霉烯類作為最有效的抗菌藥物被廣泛使用。隨著碳青霉烯類藥物消耗量的增加，耐藥菌株開始出現(xiàn)，并在全球范圍快速傳播[1-2]。耐碳青霉烯腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)通常表現(xiàn)對β-內(nèi)酰胺類藥物高水平抵抗，同時伴隨著對多種其他抗菌藥物，如氨基糖苷類、氟喹諾酮類等耐藥，使治療成為十分棘手的問題。

CRE的耐藥機制主要包括產(chǎn)生各種類型碳青霉烯酶、膜孔蛋白缺失或突變聯(lián)合ESBLs或頭孢菌素酶(AmpC)的高水平產(chǎn)生、外排泵的過度表達等[3]，其中產(chǎn)生碳青霉烯酶是最常見的耐藥機制，也是對公共健康威脅最大的因素。碳青霉烯酶屬于β-內(nèi)酰胺酶家族，能夠水解包括頭孢菌素及碳青霉烯在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類藥物?；诜肿犹卣鞯牟煌?，目前已知的碳青霉烯酶分別屬于Ambler分類中的A、B及D類，A類碳青霉烯酶活性部位有絲氨酸結(jié)構(gòu)，主要包括KPC、GES、IMI、SME和SFC，能水解青霉素類、頭孢菌素、氨曲南和碳青霉烯類抗生素，活性可被克拉維酸、他唑巴坦抑制；B類屬于金屬酶，活性部位有鋅離子，主要包括 IMP、VIM、SPM、NDM、GIM和SIM，活性不受β-內(nèi)酰胺酶抑制劑影響，可被EDTA等金屬螯合劑所抑制，不能水解氨曲南；D類主要為OXA-48-like酶，能水解青霉素類、鄰氯西林、苯唑西林等藥物。

編碼碳青霉烯酶的基因通常存在于可移動基因元件上，通過質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子容易在細菌之間水平傳播，導(dǎo)致局部流行，甚至是感染暴發(fā)[3]；同時，產(chǎn)碳青霉烯酶細菌感染常伴隨治療的失敗及高病死率。因此，快速、準確地識別產(chǎn)酶菌株，對于患者的治療及采取合適的感染控制措施，防止耐藥基因的播散具有重要意義。盡管臨床實驗室可以常規(guī)進行碳青霉烯類抗菌藥物的敏感性檢測，但是敏感性下降并不一定是由于產(chǎn)生了碳青霉烯酶。分子診斷技術(shù)是判斷細菌是否產(chǎn)生碳青霉烯酶的金標準，但檢測方法不僅步驟繁瑣，而且需要特殊的儀器設(shè)備，在臨床工作中難以廣泛開展。另外，分子診斷僅能夠?qū)σ阎愋偷拿富驒z測，對于少見的類型存在漏檢風(fēng)險。近年來，多種碳青霉烯酶表型檢測方法被廣泛應(yīng)用，每種方法都各具特色。本文對腸桿菌科細菌碳青霉烯酶表型檢測方法進行綜述，目的是通過表型檢測能簡便、準確、及時發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶株，為患者的治療及控制耐藥菌株的傳播提供幫助。

1表型篩查試驗

1.1 藥物敏感試驗 產(chǎn)生碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌(carbapenemase-producing Enterobacteriaceae CPE)通常表現(xiàn)對一種或多種碳青霉烯類藥物敏感性下降。藥物敏感性檢測方法主要為最低抑菌濃度(MIC)測定及紙片擴散法測量抑菌環(huán)直徑，當MIC值升高或抑菌環(huán)直徑縮小提示為可疑的CPE菌株。有報道指出不同的碳青霉烯藥物對CPE的篩選能力存在差異，厄他培南敏感性較高，但特異性略差，亞胺培南情況類似，美羅培南在敏感性和特異性的綜合評價中有較滿意的結(jié)果[4]。Benenson等[5]利用紙片擴散法檢測腸桿菌科細菌對亞胺培南的敏感性，判斷是否產(chǎn)生KPC酶，靈敏度和特異度分別為100%、96%。有研究應(yīng)用VITEK 2測定亞胺培南與美羅培南的MIC進行CPE篩選，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合應(yīng)用可以顯著提高檢測能力[6]。

判斷CPE的折點目前尚無統(tǒng)一標準，Tamma等[7]通過對198株CRE進行耐藥基因及碳青霉烯類藥物MIC檢測，發(fā)現(xiàn)CPE菌株與非CPE菌株的MIC值分布存在差異，不同基因型的碳青霉烯酶MIC分布無差異。研究[7]認為，篩查CPE的最佳厄他培南濃度為0.5 μg/mL，美羅培南、亞胺培南、多利培南的濃度為2 μg/mL。Pasteran等[6]發(fā)現(xiàn)，以亞胺培南MIC≥2 μg/mL聯(lián)合美羅培南MIC≥1 μg/mL作為CPE判斷標準，具有很高的靈敏度及特異度。也有學(xué)者在CPE低流行區(qū)域進行大數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示以目前美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)敏感標準(美羅培南MIC≤1 μg/mL),14%的CPE菌株對美羅培南敏感，以歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會(EUCAST)敏感標準(美羅培南MIC≤2 μg/mL)，此比率上升至20%，認為以美羅培南篩查CPE時，應(yīng)采用的折點為MIC 0.12 μg/mL[8]。

藥物敏感試驗可以方便、快捷地進行CPE篩查，同時可以根據(jù)藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥。但由于其他的耐藥機制，如膜孔蛋白缺失合并高產(chǎn)AmpC酶同樣可導(dǎo)致碳青霉烯藥物MIC值升高或抑菌環(huán)直徑縮小，有些產(chǎn)酶菌株對碳青霉烯類藥物水解能力弱，也可出現(xiàn)敏感結(jié)果。因此，產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株藥敏結(jié)果會出現(xiàn)部分重疊。

1.2 篩選培養(yǎng)基 主要有添加了碳青霉烯類藥物的麥康凱培養(yǎng)基及商業(yè)化的顯色培養(yǎng)基，可以直接從臨床標本中篩選出耐藥菌株。利用CPE對碳青霉烯抗生素敏感性下降的特性，以及麥康凱培養(yǎng)基能有效抑制革蘭陽性菌的生長，改進后的麥康凱具有很好的選擇作用。在麥康凱培養(yǎng)基中加入1 μg/mL亞胺培南用于直腸拭子篩選CPE菌株有很好的檢測效能[9]。商業(yè)化的顯色培養(yǎng)基具有篩選和鑒定雙重作用，其中的抑制劑限制了雜菌的生長，未受影響的細菌在生長過程中代謝產(chǎn)生的酶，水解培養(yǎng)基中底物，釋放色原物質(zhì)呈現(xiàn)特定顏色，利用顏色的不同對目標菌進行鑒定。Panagea等[10]使用CHROMager KPC培養(yǎng)基監(jiān)測直腸拭子標本中CPE，陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為100%、98.8%，但對于產(chǎn)KPC和VIM酶的菌株通過顏色判斷或菌落特征并不能區(qū)別。早期的顯色培養(yǎng)基具有方便、特異度高、結(jié)果易于觀察的優(yōu)點，不過主要用于篩選CRE，對CPE無特異性，并且對一些低水平耐藥的CPE菌株，敏感性較低，易出現(xiàn)漏檢。

ChromID CARBA是一種新型顯色培養(yǎng)基，專為CPE設(shè)計，添加劑中含有特異性抑制革蘭陽性菌和非產(chǎn)碳青霉烯酶細菌的成分。Perry 等[11]比較ChromID CARBA和Colorex KPC兩種培養(yǎng)基檢測產(chǎn)NDM-1酶腸桿菌科細菌的能力，認為前者更敏感，可以檢測出美羅培南MIC低于2 μg/mL的菌株。另外一種新型的篩選培養(yǎng)基SUPERCARBA，其中加入一種碳青霉烯類藥物、氯唑西林、硫酸鋅，可以篩選多種類型碳青霉烯酶，如OXA-48、NDM、VIM、IMP、KPC等，檢測靈敏度在95%以上[12]。

利用篩選培養(yǎng)基進行臨床標本中CPE的篩查是一種好方法，最大優(yōu)勢在于能從多種菌群中分離出目標菌，但是孵育過程需24～48 h，不能滿足快速檢測要求，并且不能區(qū)分碳青霉烯酶類型。

2表型確認試驗

2.1 抑制劑增效試驗 不同類型的碳青霉烯酶活性可被相應(yīng)的抑制劑所抑制，在碳青霉烯類藥物中加入酶抑制劑，可以使藥物的MIC下降或紙片擴散法的抑菌環(huán)增大。常用的方法有E-test和紙片增效試驗，前者判讀標準為加酶抑制劑一側(cè)與另一側(cè)比較MIC值相差8倍以上是陽性，后者可以將抑制劑直接加到藥物紙片中，與原藥物紙片比較抑菌環(huán)的大小，或者將抑制劑紙片貼在藥物紙片附近，觀察兩者是否出現(xiàn)協(xié)同。A類酶抑制劑有硼酸類化合物、克拉維酸等，有文獻評價兩種抑制劑對產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌檢測能力，硼酸檢出所有產(chǎn)酶株，而克拉維酸靈敏度及特異度稍差[13]。硼酸類除了能抑制A類β-內(nèi)酰胺酶，也能抑制AmpC酶，當菌株高產(chǎn)AmpC酶伴隨膜蛋白缺失時易造成假陽性，若聯(lián)合加入氯唑西林，因其僅抑制AmpC酶可以進行鑒別。B類酶抑制劑常用的有EDTA、吡啶二羧酸，兩者對于金屬酶的檢測均有很好的效果。Tsakris等[14]報道以紙片增效試驗檢測同時具有KPC和金屬酶的菌株，當美羅培南紙片中僅加入苯硼酸或EDTA一種時，結(jié)果均為陰性，只有兩者同時加入才出現(xiàn)陽性結(jié)果。OXA-48目前無理想的特異性抑制劑，但是可利用其水解替莫西林的特征進行識別。有研究者分別使用苯硼酸、吡啶二羧酸和氯唑西林作為A、B類及AmpC酶抑制劑，聯(lián)合替莫西林紙片擴散法檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶，結(jié)果顯示所有OXA-48菌株與苯硼酸和吡啶二羧酸均無協(xié)同作用，并且替莫西林抑菌環(huán)<10 mm，以此作為判斷標準，靈敏度及特異度均達100%[15]。

抑菌劑增效試驗操作簡單，結(jié)果易于觀察，可區(qū)分碳青霉烯酶類型。但是，當以EDTA作為金屬酶抑制劑時，有些菌株本身對EDTA敏感可出現(xiàn)假陽性，并且檢測過程需16～20 h的孵育，無法快速獲得結(jié)果。

2.2 改良Hodge試驗(modified Hodge test,MHT) Hodge試驗最早用于淋病奈瑟菌產(chǎn)生青霉素酶的檢測，后來Lee等[16]進行改進用于銅綠假單胞菌和不動桿菌的金屬酶篩查。2009年CLSI建議對碳青霉烯類藥物敏感性下降的腸桿菌科細菌采用MHT進行碳青霉烯酶的表型確證。MHT原理基于產(chǎn)生碳青霉烯酶的細菌使碳青霉烯藥物失活，大腸埃希菌(ATCC 25922)作為對藥物敏感的指示菌，在試驗菌株接種線與抑菌環(huán)相交處出現(xiàn)增強生長。MHT步驟簡單，不需要特殊的試劑和儀器，適合于各級實驗室常規(guī)開展，并且對于A類和D類碳青霉烯酶顯示較好的檢測能力，但是對于金屬酶，如NDM、VIM、IMP的檢測存在缺陷。一些菌株由于ESBLs或者存在高水平AmpC，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果[17]。

針對MHT的不足，研究人員進行了多種改進。有文獻報道[18]以間接碳青霉烯酶試驗檢測KPC酶，試驗步驟類似于MHT，藥敏紙片為亞胺培南，試驗菌株不是沿藥敏紙片邊緣劃線，而是涂在EDTA紙片上，貼在亞胺培南紙片邊緣，孵育過夜后觀察結(jié)果，指示菌在EDTA邊緣出現(xiàn)凹陷生長為陽性。EDTA在其中作用是裂解菌體細胞，釋放KPC酶，提高了檢測能力。對于金屬酶檢測的缺陷，有研究嘗試在培養(yǎng)基中加入硫酸鋅，檢測NDM的靈敏度從50%增高至85.7%，但特異度無改善[19]。最近研究[20]發(fā)現(xiàn)，NDM是結(jié)合在外膜上的脂蛋白；Pasteran等[21]通過在MH培養(yǎng)基中加入非離子表面活性劑Triton X-100，使MHT檢測NDM的靈敏度>90%。Takayama等[22]報道在MH培養(yǎng)基中加入氯唑西林進行MHT，AmpC導(dǎo)致的假陽性被有效控制。也有研究以麥康凱培養(yǎng)基代替MH，敏感性明顯提高，可能是麥康凱中的抑制物如膽鹽增加了胞內(nèi)酶的釋放[23]。

2.3 Carba NP試驗 2012年Nordmann等[24]報道了一種新型的快速檢測細菌水解亞胺培南能力的試驗，稱為Carba NP，試驗原理基于生化顯色。碳青霉烯酶能水解亞胺培南的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使溶液pH下降，其中的酚紅指示劑顏色發(fā)生紅色到黃色的改變。整個實驗過程僅需要2 h，縮短了檢測時間，能早期識別CPE菌株。2015年CLSI推薦Carba NP作為腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌和不動桿菌屬產(chǎn)生碳青霉烯酶的表型確證試驗[24]。據(jù)報道本試驗有高特異性，對于KPC酶及金屬酶的檢測有高靈敏度，但是對于OXA-48-like的敏感性報道不一，11%～100%[24-26]。Segawa等[27]以此試驗檢測IMP-6及IMP-1型酶，發(fā)現(xiàn)陽性出現(xiàn)時間與酶基因的表達水平顯著相關(guān)，提示Carba NP有潛力用于評價碳青霉烯酶基因的表達程度。

盡管Carba NP簡單快速，但是影響因素較多，如配制試驗溶液pH、待測菌分離選用的培養(yǎng)基、接種量、孵育時間、結(jié)果判定的主觀因素、黏液型的表型以及酶活性表達水平等均會對結(jié)果造成影響[26,28]。另外，試驗需要一些特殊的試劑，如商品化蛋白提取液(B-PER II)、亞胺培南標準品粉劑等，不僅試驗成本較高，而且亞胺培南粉劑加入后試劑要盡快使用，有效期僅3 d，限制了該試驗的推廣應(yīng)用?，F(xiàn)在一些商品化的試劑盒應(yīng)運而生，如Rapidec Carba NP、Rosco Neo-Rapid Carb Kit等，據(jù)報道上述商品化產(chǎn)品具有同樣的檢測性能，操作更簡便[29-30]。Pires等[31]介紹了一種替代試驗(Blue-Carba)，不需要蛋白提取液，直接從培養(yǎng)基取菌使用，以靜脈滴注使用的亞胺培南/西司他丁代替亞胺培南標準品，選擇溴麝香草酚藍作為指示劑替代酚紅。據(jù)描述Blue-Carba具有很高的檢測能力，而且減少了試劑花費，簡化了試驗操作，同時因為溴麝香草酚藍變色范圍在pH 6.0～7.6，覆蓋了大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶(pH 6.8)，水解后引起的顏色變化更明顯。也有文獻[32]報道以Triton X-100代替蛋白提取液，亞胺培南/西司他丁代替亞胺培南標準品，同樣取得了滿意的結(jié)果。有研究[33]對此方法進行改進，將配制好的亞胺培南酚紅混合溶液及單一酚紅溶液(作為對照)分別滴加在濾紙條上，然后取培養(yǎng)基上的菌落直接涂在濾紙上，5 min內(nèi)根據(jù)顏色變化判讀結(jié)果，也取得了理想效果，方便、快速、直觀的方法更易被臨床實驗室所接受。

2.4 碳青霉烯滅活試驗(carbapenem inactivation method，CIM) CIM 2015年由荷蘭van der Zwaluw研究團隊首次提出，可以在8 h內(nèi)檢測革蘭陰性桿菌的碳青霉烯酶，對KPC、NDM、OXA-48、VIM、IMP 和 OXA-23型β-內(nèi)酰胺酶的檢測結(jié)果與PCR具有高度一致性[34]。操作如下：(1)取一滿環(huán)血平板或MH上菌株加入實驗室用水中，做成均勻菌懸液，夾一片10 μg美羅培南藥敏紙片浸入菌懸液，35℃孵育2 h；(2)大腸埃希菌(ATCC 25922)以生理鹽水制成0.5麥氏單位菌懸液，按照常規(guī)紙片擴散法操作涂布于MH平板表面；(3)取出美羅培南紙片貼在已涂布大腸埃希菌的MH平板上，35℃至少孵育6 h或過夜判讀結(jié)果。如果待檢菌株產(chǎn)生碳青霉烯酶，作用于藥敏紙片中的美羅培南使其失去活性，指示菌的生長就不受影響，反之指示菌生長被抑制，在美羅培南周圍出現(xiàn)明顯抑菌圈。對203株碳青霉烯耐藥的革蘭陰性桿菌進行CIM和Carba NP實驗，結(jié)果與多重PCR比較，CIM靈敏度和特異度分別為95.7%、95.5%，而CarbaNP分別為75.0%、99.1%[35]。2017年CLSI 推薦了改良CIM試驗(mCIM)用于腸桿菌科細菌產(chǎn)生碳青霉烯酶的表型確認試驗[36]，mCIM與CIM的區(qū)別在于菌懸液使用胰蛋白酶大豆肉湯代替實驗室用水制備，加入美羅培南紙片后孵育時間從2 h延長至4 h。Pierce等[37]對mCIM進行評價，認為該試驗不僅操作簡單，而且結(jié)果易于判斷、重現(xiàn)性好。

CIM試驗試劑花費少，容易操作，結(jié)果判斷明確，檢測OXA-48-like靈敏度高[35,37]，但試驗需孵育2次，第一次2～4 h，第二次至少6 h或過夜，操作時間長，不能達到快速檢測的目的，另外當酶活性較低時會出現(xiàn)假陰性結(jié)果[38]。

2.5 其他表型確認試驗 以抗體介導(dǎo)為基礎(chǔ)的免疫層析方法開始應(yīng)用于檢測碳青霉烯酶，表現(xiàn)了良好的性能，尤其對于OXA-48-like的檢測有一定的優(yōu)勢。攜帶OXA-48-like酶的菌株常表現(xiàn)為對碳青霉烯類藥物的低MIC值，并且不同于KPC 和金屬酶，OXA-48-like缺乏用于表型檢測所需的特異性抑制劑，在常規(guī)檢驗中易造成漏檢。一種商品化的產(chǎn)品OXA-48 K-SeT檢測OXA-48-like的靈敏度和特異度均達100%[39]。試驗原理基于抗體捕獲OXA-48酶的兩個特異性抗原表位，將其中之一的特異性抗體以條帶狀固定在硝酸纖維膜上，膠體金標記另一抗體吸附在結(jié)合墊上。當待檢樣品加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記抗體后發(fā)生特異性結(jié)合，再移動至固化抗體區(qū)域時又發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色條帶。捕獲抗體可以結(jié)合目前已知的多種OXA-48-like變異體，如OXA-48、OXA-162、OXA-181、OXA-204、OXA-232和OXA -244等，15 min內(nèi)獲得結(jié)果。最近報道了一種新型多通道免疫層析試劑OKN K-SeT，可以同時檢測OXA-48、KPC、NDM，對于含有目標酶的菌株均能正確檢出，非CPE或產(chǎn)生其他類型碳青霉烯酶菌株無交叉反應(yīng)，表現(xiàn)高效的檢測性能[40]。免疫層析分析操作簡單，結(jié)果快速、準確，敏感性高，不需要其他附加的試劑和儀器，易于在臨床實驗室開展，并且檢測限在106CFU/mL，有希望直接從尿或其他生物樣本中進行檢測,但是因為屬于商品化試劑，試劑花費較多，并且只能對目標酶型進行檢測，存在局限性。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)是一種軟電離技術(shù)，將樣品分散在基質(zhì)中，在激光照射下分子電離，電離的樣品在電場作用下飛過真空的飛行管，通過離子的質(zhì)量電荷之比與離子的飛行時間成正比分析離子，測得樣品分子的分子量達到鑒定目的。MALDI-TOF/MS通常用于疾病的診斷和藥物代謝研究，近年來在微生物的鑒定方面應(yīng)用較多，對于耐藥機制檢測方面也有很大潛能。Hrabák等[41]描述了以質(zhì)譜方法檢測腸桿菌科細菌及銅綠假單胞菌產(chǎn)酶引起的碳青霉烯類藥物耐藥，美羅培南溶液與細菌培養(yǎng)物混合后35℃孵育3 h，混合液離心，上清液用于質(zhì)譜分析，以美羅培南及其鈉鹽特征峰的出現(xiàn)與否判斷結(jié)果，方法的靈敏度和特異度分別為96.67%、97.87%。該方法簡便快速、高通量、低成本、可信度高，除了用于細菌純培養(yǎng)物檢測，還可以直接從血培養(yǎng)中測定，節(jié)省了時間，對KPC、VIM、NDM、IMP、OXA-48-like均有很高的檢出能力[42]。但是質(zhì)譜儀價格昂貴，普通微生物實驗室難以配置，并且不能區(qū)分碳青霉烯酶類型，對于流行病學(xué)調(diào)查的作用有限。

3總結(jié)與展望

細菌耐藥已經(jīng)成為全球化的問題，特別是CPE引起的感染，由于其高傳播性及高病死率，應(yīng)引起臨床及感控人員的高度重視。準確、及時發(fā)現(xiàn)CPE菌株，對于患者的治療及感控措施的實施至關(guān)重要。不同的檢測方法對不同類型碳青霉烯酶存在檢測能力上的差異，截至目前，仍缺乏一種完美檢測手段，實驗室應(yīng)根據(jù)自己的條件及地區(qū)流行情況進行選擇。

顯色培養(yǎng)基可以從臨床標本中直觀地分離出產(chǎn)酶菌株，在去定植檢測中有很好的應(yīng)用前景。免疫層析法對KPC、NDM、OXA-48等常見類型可以在15 min得出結(jié)果，當懷疑由相關(guān)機制引起的感染暴發(fā)時，該法是不錯的選擇。MALDI-TOF/MS作為新型的檢測手段開始用于細菌耐藥方面的研究，目前對于CPE的檢測主要依據(jù)碳青霉烯藥物的水解，對具體的酶類型無法分辨，如果能對酶類型進行檢測，將會有更大的應(yīng)用空間。

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