于賢金 何亞紅 張筱鳳

近年來，胰腺癌的發(fā)病率及死亡率在全球范圍內(nèi)逐年上升。美國2017年預計胰腺癌新發(fā)53 670例，死亡43 090例，排在所有腫瘤死亡原因的第4位[1]，預計到2020年，將排在所有腫瘤死亡原因的第2位[2]。大部分胰腺癌患者確診時已屬于晚期，僅有10%～15%的患者有根治手術機會[3]。因此，以吉西他濱（gemcitabine，GEM）為基礎的化療成為進展期胰腺癌患者的重要治療方法[4]。GEM可顯著提高疾病無進展時間及3～5年生存率，但在中位生存期及1年生存率方面提高仍不明顯[5]。細梗香草又名滿山香、香排草，為報春花科珍珠菜屬植物，民間將細梗香草用于治療感冒咳嗽、風濕痹痛、抗腫瘤等，該植物中的主要成分皂苷有較強的抗腫瘤作用[6]。相關體外實驗證實，皂苷對于肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等癌癥均有一定的抑制作用[7-8]。本研究觀察了細梗香草皂苷（lysimachia capillipes，LC）單獨及與GEM聯(lián)用對胰腺癌BxPC-3細胞增殖和凋亡的影響，并初步研究了LC抗胰腺癌的作用機制，為探討臨床LC聯(lián)用GEM治療胰腺癌的可行性提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 BxPC-3細胞株由上海長海醫(yī)院中心實驗室提供。LC由浙江大學生物醫(yī)學工程學系實驗室提供。GEM（健擇/Gemzar）由美國禮來公司提供（規(guī)格200mg），保存于4℃冰箱。RPMI-1640培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA（0.25%）胰蛋白酶、FBS、青霉素-鏈霉素抗生素購于美國GIBCO公司。MTS細胞增殖試劑盒（MTS法）購于美國艾美捷科技有限公司。Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑及細胞周期檢測試劑購于杭州聯(lián)科生物技術有限公司。抗多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抗體、抗半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體購于英國abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞株BxPC-3培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。細胞單層貼壁生長，至70%～80%時胰蛋白酶消化傳代。取復蘇傳代后生長狀態(tài)良好的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞增殖抑制率檢測 將BxPC-3細胞以5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后分別加入0、2、4、8、16、32、64、100μg/ml 的 LC 和 0、1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L的GEM，繼續(xù)培養(yǎng)48h。采用MTS法檢測細胞增殖抑制率，吸棄原來的培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基100μl/孔，再加入 MTS 試劑 20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng) 1h，用酶標儀測定490nm處的吸光度（OD）。細胞增殖抑制率=（1-觀察組OD490/對照組OD490）×100%，細胞存活率=100%-細胞增殖抑制率。再以藥物濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標，繪制量效曲線，得到半抑制濃度（IC50）。1.2.3 藥物聯(lián)用實驗 將BxPC-3細胞以5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后聯(lián)合加入LC與GEM（根據(jù)細胞增殖抑制試驗結果調(diào)整濃度梯度：LC為5、10、15、20、25μg/ml，GEM 為 1、3、5、10、30μmol/L，并分別配對）。采用MTS法檢測并計算出各藥物濃度下細胞增殖抑制率，計算出藥物聯(lián)合作用指數(shù)（combined index，CI）。CI判斷兩種藥物的協(xié)同性，CI=DA/ICX，A+DB/ICX,B（A和B代表兩種不同藥物，ICX,A和ICX,B是兩種藥物單獨使用使增殖抑制率達X時的藥物濃度，DA和DB是兩種藥物聯(lián)合作用使增殖抑制率達X時的藥物濃度）。本實驗運用Calcusyn 2.0軟件計算LC與GEM聯(lián)用的CI值。CI值大于、等于和小于1，分別對應了兩種藥物具有拮抗、疊加和協(xié)同作用，當CI值＜1時，數(shù)值越小，協(xié)同作用越大[9]。

1.2.4 細胞處理與分組 選取對數(shù)生長期的BxPC-3細胞，以3×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24h細胞貼壁后加入不同濃度藥物，分為（1）對照空白組：不加藥物干預（A 組）；（2）GEM 1μmol/L 組（B 組）；（3）LC 15μg/ml組（C 組）；（4）GEM 1μmol/L+LC 15μg/ml組（D 組）。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 根據(jù)1.2.4處理與分組細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48h后用不含EDTA的胰酶消化、收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，收集（1～5）×105細胞。加入100μl 1×Binding Buffer重懸細胞。加入5μl Annexin V-FITC 和 5μl PI Staining Solution，輕輕混勻。避光、室溫反應 10min。加入 400μl 1×Binding Buffer，混勻，樣品在1h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 Western blot法檢測PARP、Caspase-3蛋白表達水平 根據(jù)1.2.4處理與分組細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，制備10%SDS-PAGE凝膠。每孔加入20μg樣品進行電泳，半干法轉膜，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉液封閉 1h，分別加入相應一抗（1∶1 000 稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗膜 3次，二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育 1h，應用ECL化學發(fā)光顯色，以β-肌動蛋白（β-Actin）為內(nèi)參，檢驗試驗準確性。Band Leader軟件進行條帶灰度半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的LC和GEM對BxPC-3細胞的增殖抑制率 不同濃度的LC和GEM干預BxPC-3細胞并培養(yǎng) 48h后，8～64μg/ml的 LC 及 1.25～20μmol/L 的 GEM均對BxPC-3細胞的增殖有抑制作用，且呈濃度依賴性， 其IC50分別為16.55μg/ml和1.27μmol/L，見圖1-2。

圖1 LC對BxPC-3細胞的增殖抑制作用

圖2 GEM對BxPC-3細胞的增殖抑制作用

2.2 藥物聯(lián)合實驗結果 通過Calcusyn 2.0軟件計算出 15μg/ml與 20μg/ml的 LC與各濃度 GEM 的 CI值均＜1，具有協(xié)同作用。其中15μg/ml的LC與各個濃度的GEM協(xié)同作用最強，CI值為0.53～0.65，見表1。結合兩種藥物的IC50值結果，實驗選取單用GEM 1μmol/L，LC 15μg/ml，聯(lián)用藥物 GEM 1μmol/L+LC 15μg/ml的濃度進行后續(xù)研究。

2.3 藥物對BxPC-3細胞凋亡的影響 藥物作用于BxPC-3細胞 48h后，A、B、C、D 組早期凋亡率分別為（0.8±0.22）%、（16.0±0.33）%、（64.5±0.29）%、（93.2±0.29）%，晚期凋亡率分別為（1.9±0.50）%、（12.3±0.58）%、（9.7±0.50）%、（2.8±0.24）%，見圖 3。B、C、D 組的早、晚期凋亡率與A組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），且D組與B、C組的早期凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.01）。

表1 各濃度LC與GEM聯(lián)合用藥的CI值

圖3 細胞凋亡流式分析圖

2.4 4組PARP和Caspase-3蛋白表達水平比較 C、D組與A組比較，PARP蛋白表達水平明顯降低（均P＜0.05）；B、C、D 組與 A 組比較，Caspase-3蛋白表達水平增加（均 P＜0.05），見圖 4-5。

3 討論

目前胰腺癌病因尚不明確，可能的危險因素有年齡、吸煙、酒精攝入、肥胖、慢性胰腺炎、基因改變和飲食等[10]，發(fā)病機制的不明確造成了治療進展停滯不前。胰腺癌早期診斷極其困難，只有少部分患者發(fā)現(xiàn)后有機會進行根治性手術治療。GEM是胰腺癌的標準化療藥物[4]。GEM可顯著提高疾病無進展時間及3～5年生存率，但在中位生存期及1年生存率方面提高不明顯[5]。而GEM聯(lián)合其他藥物或放療，治療效果也未見顯著優(yōu)勢，聯(lián)合化療還可能增加細胞毒性反應[11-15]。其他治療如內(nèi)鏡治療包括內(nèi)鏡下化療、冷凍療法、光動力和射頻消融等方法，但沒有臨床證據(jù)支持其療效優(yōu)于標準療法[16]。

圖4 4組PARP和Caspase-3蛋白表達電泳圖

圖5 4組PARP和Caspase-3蛋白表達水平比較（注：與A組相比，*P＜0.05）

在我國，傳統(tǒng)中醫(yī)對于疾病的觀點及治療有著顯著的特色，其在腫瘤的治療方面也取得了不少突破。晚期腫瘤患者以中醫(yī)藥為主治療可明顯提高生活質(zhì)量，延長生存期。而且中藥與化療伍用還具有較為顯著的增效減毒作用。有研究表明中藥可以直接殺傷腫瘤細胞、誘導腫瘤細胞凋亡與分化以及中藥逆轉多藥耐藥效應[17]。LC已在體外試驗中被證實對多種腫瘤具有抑制作用。

本實驗采取MTS法檢測LC單獨及與GEM聯(lián)用對BxPC-3細胞增殖的影響，結果顯示LC、GEM對人胰腺癌BxPC-3細胞有增殖抑制作用，且呈濃度依賴性。本研究發(fā)現(xiàn)15μg/ml的LC與1μmol/L的GEM的CI值為0.58，有高度協(xié)同作用。此時兩藥濃度都小于各自的IC50濃度，說明LC可增加GEM抗腫瘤療效。

細胞凋亡是機體正常細胞受到生理和病理性刺激后自發(fā)的程序性死亡，可及時清除機體內(nèi)受損傷和異常的細胞，維持組織器官的穩(wěn)定性。它的啟動與進行受到精確而復雜的信號系統(tǒng)調(diào)控。影響細胞凋亡信號的轉導途徑，誘發(fā)細胞凋亡，是抗腫瘤藥物抑制腫瘤的一條重要作用機制。Caspase基因家族在細胞凋亡過程中起著至關重要的作用，在胰腺癌細胞的凋亡中起到極其重要的作用，許多研究表明胰腺癌的致病機制及靶點均通過Caspase家族起作用[18-20]，其中Caspase-3處于凋亡有序級聯(lián)反應的下游，是最重要的效應型關鍵凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起后樞紐作用[21]，大多數(shù)觸發(fā)細胞凋亡的因素，最終均需要通過Caspase-3介導的信號傳遞途徑導致細胞凋亡，很多腫瘤組織中Caspase-3表達量較正常組織明顯降低。另外，PARP能通過識別結構損傷的DNA片段而被激活，被認為是DNA損傷的感受器，能參與修復受損 DNA、保持染色體結構完整性。Caspase-3能特異性分解PARP使其失去結合DNA的能力，抑制其修復DNA[22]。

本實驗結果表明LC、GEM單藥及聯(lián)合用藥作用于人胰腺癌BxPC-3細胞可促進細胞凋亡，聯(lián)合用藥組凋亡率明顯高于單藥組。另外，筆者觀察到LC單藥組與LC、GEM聯(lián)合用藥作用于BxPC-3細胞后，細胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達明顯增加，PARP蛋白表達減少。LC及其聯(lián)合用藥抑制胰腺癌細胞質(zhì)增殖及促進胰腺癌細胞凋亡的機制可能是通過Caspas-3和PARP途徑來實現(xiàn)。至于是通過哪種細胞信號通路和信號分子激活這兩種酶，有待進一步深入研究。

綜上所述，本研究證實了LC對人胰腺癌細胞具有抑制作用，LC與GEM具有高度協(xié)同作用，聯(lián)合用藥可提高療效。LC可能是通過激活Caspase-3，分解PARP，誘導胰腺癌細胞凋亡。為進一步研究LC抗胰腺癌的信號通路機制及LC用于胰腺癌臨床研究提供一定實驗依據(jù)。

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