王雷，杜媛鯤，米源，廖海江，陳閣，張耀中，劉慶熠

（河北醫(yī)科大學(xué) 1. 第四醫(yī)院胸二科，石家莊 050011； 2. 期刊社，石家莊 050017）

我國每年新發(fā)生胃癌近50萬例，占全球近半 數(shù)，并以每年1.6%的速度上升［1］?；颊呔驮\時多屬于進(jìn)展期，即使采取手術(shù)為主、放化療為輔的綜合治療，總體治愈率仍徘徊于20%～30%。Hedgehog/Gli信號通路在肺腺癌［2］、口腔鱗癌［3］、乳腺癌［4］和肝癌［5］等多種腫瘤中異?；罨?，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，經(jīng)典的刺猬因子 （Hedgehog，Hh） 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是Hh配體與12跨膜受體蛋白（patched，PTCH） 受體結(jié)合，激活第2個跨膜蛋白7跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白 （smoothened，SMO） ，活化的SMO進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活下游核轉(zhuǎn)錄因子Gli，活化的Gli1和Gli2激發(fā)包括Wnt、CyclinD1等多種靶基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化與凋亡［6］。既往抗腫瘤研究多針對通路上游SMO靶點(diǎn)，但近年來發(fā)現(xiàn)Gli在癌癥發(fā)生、發(fā)展中的作用比SMO更重要［7］。

磷脂酰肌醇-3激酶 （phosphatidvlinositol-3-kinases，PI3K） 是一類特異的催化磷脂酰肌醇脂物質(zhì)的激酶。蛋白激酶B （protein kinase B，AKT） 是PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心，作為PI3K下游的靶蛋白，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［8-9］。促進(jìn)轉(zhuǎn)移的機(jī)制包括影響細(xì)胞外基質(zhì)，降低細(xì)胞間黏附力，增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力等。近年的研究［10-12］發(fā)現(xiàn)，Hh信號通路可與PI3K/AKT信號通路通過交叉調(diào)控現(xiàn)象促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，然而胃癌組織中Hh/Gli信號通路是否通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮促進(jìn)轉(zhuǎn)移作用尚缺乏直接證據(jù)。本研究擬探討人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)Z521中Gli表達(dá)和PI3K/AKT通路的關(guān)系，旨在進(jìn)一步明確腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制，以期為胃癌的靶向治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑：人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)Z521（ 英國Sigma-Aldrich公司） ，胰酶和胎牛血清（ 美國Gemini公司） ，總RNA提取試劑盒（ 德國 Qiagen公司） ，cDNA合成試劑盒、Pierce-BCA蛋白分析試劑盒、Mini-PROTEAN TGX 預(yù)制膠、Tris/甘氨酸/電泳緩沖液（ 美國伯樂公司） ，Ham和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液（美國Gibco公司） ，Taqman基因表達(dá)預(yù)混液（ 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司） ，Gli1引物及探針（ Hs00171790）、E-cadherin（ CDH1） 引物及探針（ Hs00958111_m1）、N-cadherin（ CDH2） 引物及探針（ Hs00983056_m1）、Gli2引物及探針（ Hs01119974_m1）、內(nèi)參GAPDH引物及探針（ Hs02758991_g1） （ 美國生命技術(shù)公司） ，蛋白酶抑制劑（ 德國羅氏公司） ，M-PER培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取試劑、ECL試劑（ 美國賽默飛公司） ，Gli1兔抗人多克隆抗體（ ab49314） 和E-cadherin鼠抗人單克隆抗體（ ab1416） （ 美國Abcam公司） ，AKT兔抗人單克隆抗體 （#9272）、p-AKT兔抗人單克隆抗體（Ser473， #4060） （美國 cell signaling公司） ， Gli2鼠抗人單克隆抗體 （sc-271786）、N-cadherin 兔抗人單克隆抗體 （sc-7939）、GAPDH鼠抗人單克隆抗體 （sc32233）（美國Santa Cruz公司） ，matrigel基質(zhì)膠 （美國BD公司） ，GANT61 （美國Selleckchem公司） ，N-Shh蛋白（美國EBioscience公司） 。

1.1.2 主要儀器：NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計 （美國賽默飛公司） ，小型 Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽 （美國伯樂公司） ，ABI Prism 7900HT型熒光定量PCR儀 （美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司） ，ELX800多功能酶標(biāo)儀 （美國伯騰儀器有限公司）

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：AZ521細(xì)胞均培養(yǎng)于伊格爾氏最低限度必需介質(zhì)培養(yǎng)基 （EMEM） ，其中含10%胎牛血清和100 mg/mL青-鏈霉素，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。將細(xì)胞分為4組，即DMSO組 （1%DMSO處理細(xì)胞24 h）、GANT61組 （10 μ mol/L GANT61處理細(xì)胞24 h）、N-Shh蛋白組 （0.5 mg/mL N-Shh處理細(xì)胞24 h）以及GANT61&N-Shh組 （10 μ mol/L GANT61處理細(xì)胞30 min后，0.5 mg/mL N-Shh處理細(xì)胞24 h） 。

1.2.2 實時熒光定量PCR：用0.25%胰酶消化培養(yǎng)瓶中生長狀態(tài)良好的的細(xì)胞，離心和細(xì)胞計數(shù)后按0.1×106/孔鋪于12孔板，待第2天細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合時，更換無血清培養(yǎng)基。按照試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，經(jīng)NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計檢測濃度后，行cDNA反轉(zhuǎn)錄 （反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min） ，并用無RNase水稀釋10倍。將反應(yīng)體系 （cDNA 4.5 μ L，Gli1、Gli2、E-cadherin、N-cadherin和GAPDH各 自 的引物和探針0.5 μ L，Taqman基因表達(dá)預(yù)混液5 μ L） 混勻后，按10 μ L/孔加樣于384孔板上，行PCR （反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s；60 ℃ 10 s；72 ℃ 10 s，共40 個循環(huán)） 。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 Western blotting：常規(guī)提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定每組樣本的總蛋白濃度。在Mini-PROTEAN TGX 預(yù)制膠中上樣 （10 μ g蛋白/道） ，行SDS電泳 （200 V，40 min） 。冰水浴轉(zhuǎn)移至PVDF膜 （100V，40 min） 。5% 脫脂奶粉/TBST液封膜1 h，分別加入一抗 （Gli11∶1 000稀釋，Gli2 1∶250稀釋，E-cadherin 1∶10 000稀釋，N-cadherin 1∶250稀釋、AKT 1∶1 000稀釋，p-AKT 1∶1 000稀釋，GAPDH 1∶ 20 000稀釋） ，4 ℃過夜。次日更換二抗前后各用TBST洗膜3次，每次10 min，分別加入二抗 （羊抗兔或羊抗鼠均為1∶10 000稀釋） ，室溫孵育1 h。ECL顯色5 min，X線曝光顯影，用Image軟件進(jìn)行分析，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 transwell侵襲實驗：將matrigel基質(zhì)膠用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋 （1∶4） 后鋪于小室的聚碳酸酯膜表面，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱固化。收集各組細(xì)胞并用無血清培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。分別將細(xì)胞懸液100 μ L（7.5×104個細(xì)胞） 和含10%血清培養(yǎng)液500 μ L加入上室和下室。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將聚碳酸酯膜上的細(xì)胞固定、染色，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取4個視野 （×400） ，計數(shù)每組穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用x-±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2組之間比較采用LSD方法。檢驗標(biāo)準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 實時PCR結(jié)果

實時PCR結(jié)果示：各組Gli1、Gli2、E-cadherin和N-cadherinmRNA表達(dá)水平有統(tǒng)計學(xué)差異 （均P＜0.001） 。與DMSO組相比，GANT61組和GANT61&NShh組Gli1、Gli2、N-cadherinmRNA表達(dá)水平均降低，E-cadherinmRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.001） ；N-Shh組Gli1、Gli2、N-cadherinmRNA表達(dá)水平均升高，E-cadherinmRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （均P＜ 0.001） 。GANT61&NShh組Gli1、Gli2和N-cadherinmRNA表達(dá)水平高于GANT61組 （P＜ 0.001，P＜ 0.001，P= 0.046） ；E-cadherinmRNA表達(dá)水平低于GANT61組 （P＜ 0.001） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1，圖1。

2.2 Western blotting結(jié)果

Western blotting結(jié)果表明，各組Gli1、Gli2、p-AKT、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜ 0.001） ，AKT蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異 （F=2.839，P= 0.106） ，見表2。與DMSO組相比，GANT61組和N-Shh處理組Gli1、 Gli2、 p-AKT和N-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著降低 （均P＜ 0.001） ，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高 （均P＜ 0.001） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與DMSO對照組相比，GANT61&N-Shh組Gli1、Gli2、p-AKT和N-cadherin蛋白表達(dá)水平部分上調(diào) （均P＜ 0.001） ，E-cadherin蛋白表達(dá)水平部分下調(diào) （P=0.007） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GANT61&N-Shh組Gli1（P＜ 0.001）、 Gli2 （P＜ 0.001）、 p-AKT （P＜ 0.001） 和N-cadherin （P= 0.022） 蛋白表達(dá)水平高于GANT61組，E-cadherin蛋白表達(dá)水平低于GANT61組 （P＜0.001） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2，圖2。

表1 實時PCR結(jié)果Tab.1 Results of real-time fluorescence quantitative PCR

圖1 實時PCR結(jié)果Fig. 1 Real-time quantitative PCR results

2.3 transwell侵襲實驗結(jié)果

transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，各組穿膜細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F= 781.208，P＜ 0.001） 。與DMSO組 （137±2.52） 比較，GANT61組、GANT61&NShh組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少 （58±2.00，72±4.00，均P＜ 0.001） ，N-Shh組 穿 膜 細(xì) 胞 數(shù) 明 顯 增 多（168±4.04，P＜ 0.001） 。GANT61&N-Shh組 穿 膜 細(xì)胞數(shù)較GANT61組穿膜細(xì)胞數(shù)增多 （P＜ 0.001） 。見圖3。

表2 各組Gli1、Gli2、p-AKT、E-cadherin、N-cadherin、AKT蛋白表達(dá)Western blotting結(jié)果Tab.2 Western blotting results of Gli1，Gli2，p-AKT，E-cadherin，N-cadherin，and AKT protein expression in gastric cancer AZ521 cells of each group

圖2 AZ521中Gli1、Gli2 、p-AKT、AKT、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)Western blotting檢測結(jié)果Fig.2 Western blotting analysis of Gli1，Gli2，p-AKT，AKT，E-cadherin and N-cadherin protein expression in AZ521 cells

3 討論

在腫瘤細(xì)胞中尋找特異性更強(qiáng)和靈敏度更高的標(biāo)記物及靶標(biāo)已成為目前抗腫瘤治療的重要策略，研究表明Shh和Gli是Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵因子，分別位于通路上下游的樞紐位置，兩者表達(dá)水平的上調(diào)代表Hh信號通路的激活。近年來，研究［13-14］發(fā)現(xiàn)Gli作為核轉(zhuǎn)錄因子處于下游的核心位置，可調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移，針對Gli靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控比抑制Hh上游SMO具有更高效的抗腫瘤作用，被認(rèn)為是更有前途的治療策略。

圖3 Transwell侵襲實驗檢測各組AZ521細(xì)胞侵襲能力Fig.3 Transwell invasion assay to detect the invasive ability of each group of AZ521 cells

PI3K/Akt通路是細(xì)胞中最重要的細(xì)胞級聯(lián)信號通路之一，主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化、凋亡和轉(zhuǎn)移等過程，其通路中人第10號染色體磷酸酶 缺失、AKT及下游mTOR等磷酸化預(yù)示著腫瘤患者的預(yù)后較差，抑制PI3K通路可以降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［15-17］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT） 是腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。N-cadherin是間質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)記之一，在多種上皮細(xì)胞來源的腫瘤中，N-cadherin高表達(dá)是EMT的重要特征，可以作為判斷預(yù)后的指標(biāo)，其高表達(dá)患者預(yù)后差，基因沉默N-cadherin可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［18-19］。E-cadherin屬于Ⅰ型鈣黏著蛋白，其表達(dá)缺失可導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲，與多種上皮惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后存在密切關(guān)系［20-21］。ISLAM等［22］研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)Shh/Gli信號通路可以下調(diào)EMT進(jìn)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。因此，本研究選取Gli1和Gli2的特異性抑制劑GANT61對胃癌細(xì)胞進(jìn)行研究，初步探討Gli是否通過激活PI3K通路影響胃癌細(xì)胞EMT進(jìn)程、導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，并探討其機(jī)制。

GANT61作為Gli1和Gli2的靶向抑制劑，可以通過調(diào)控細(xì)胞增殖、抑制EMT等過程，發(fā)揮良好的抗腫瘤效果［23-24］。本研究參考LIN等［25］應(yīng)用GANT61抗髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的實驗方法，采用GANT61處理AZ521細(xì)胞24 h并觀察抗腫瘤效果，結(jié)果顯示，GANT61可明顯下調(diào)AZ521細(xì)胞Gli1、Gli2和N-cadherin基因表達(dá)以及Gli1、Gli2、p-AKT和N-cadherin蛋白表達(dá)，上調(diào)E-cadherin基因和蛋白表達(dá)，而AKT蛋白表達(dá)沒有顯著變化；采用N-Shh刺激Hh/Gli通路，可顯著上調(diào)胃癌細(xì)胞的Gli1、Gli2和N-cadherin基因和蛋白表達(dá)和p-AKT蛋白表達(dá)，下調(diào)E-cadherin基因和蛋白表達(dá)。為了能更好地理解Gli和PI3K通路的關(guān)系，本研究進(jìn)行了救援實驗，即先應(yīng)用GANT61抑制Hh/Gli通路后再應(yīng)用N-Shh活化Hh/Gli通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)N-Shh可以部分恢復(fù)Gli1、Gli2 、p-AKT和N-cadherin蛋白表達(dá)。侵襲實驗結(jié)果也進(jìn)一步證實了抑制Gli的表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的侵襲，而刺激Shh/Gli通路可以明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。分析其原因可能是在胃癌AZ521細(xì)胞中存在Shh/Gli通路和PI3K/AKT通路同時激活，并且兩者之間存在“串話”關(guān)系，PI3K/AKT信號通路在Shh信號通路調(diào)控胃癌細(xì)胞EMT的過程中可能發(fā)揮著重要作用，Gli通過活化p-AKT進(jìn)而上調(diào)N-cadherin和下調(diào)E-cadherin的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT。

綜上所述，胃癌的EMT進(jìn)程與腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)錄因子以及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間密切相關(guān)，而這些通路之間的相互作用關(guān)系尚未完全闡明。本研究結(jié)果表明胃癌細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子Gli的異?；罨蚉I3K/AKT信號通路的表達(dá)之間存在密切聯(lián)系，這種細(xì)胞信號通路之間的“串話”聯(lián)系對于胃癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移可能是一個關(guān)鍵機(jī)制。

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