于婷,王小梅
(錦州醫(yī)科大學 1. 研究生學院; 2. 附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學科特需病房,遼寧 錦州 121001)
心肌纖維化 (myocardial fibrosis,MF) 是指心肌間質中的心肌成纖維細胞 (cardiac fibroblasts,CFs)過度增殖和細胞外基質過度沉積的病理變化。MF的發(fā)生機制較為復雜,糖尿病時體內的高糖環(huán)境是引起MF的一個重要原因[1]。CFs是MF的主要作用細胞,在某些因素刺激下可過度增殖并分泌大量膠原蛋白,從而引起MF[2]。因此,尋找能夠抑制CFs過度增殖的藥物對治療MF的意義重大。據(jù)目前多項研究[3]表明,通心絡 (tongxinluo,TXL) 在治療MF方面效果顯著。糖尿病MF大鼠經過TXL的治療后,其心功能及心肌超微結構得到明顯改善,心肌組織間的膠原纖維沉積顯著降低,MF得到有效控制。但TXL對CFs的影響目前國內外少有研究。本研究旨在用高糖培養(yǎng)模擬誘發(fā)MF的病理內環(huán)境,觀察TXL對高糖培養(yǎng)下CFs增殖和凋亡的影響,探討TXL治療MF的可能機制。
1~3日齡的新生SD大鼠,雌雄不限 (錦州醫(yī)科大學實驗動物中心提供) ;TXL超微粉 (中國河北以嶺藥業(yè)提供) ,DMEM培養(yǎng)基 (美國Hyclone公司) ,胎牛血清 (美國Gibco公司) ,EDTA胰酶、MTT、DMSO(美國Sigma公司) ,鼠抗波形蛋白抗體 (中國漢博士德生物工程有限公司) ,BCA蛋白定量試劑盒 (美國Pierce公司) ,抗bax、Bcl-2、GAPDH多克隆抗體 (英國Abcom公司) ,HRP結合的二抗 (北京中杉公司) ;恒溫CO2培養(yǎng)箱 (美國Thermo Electron公司) ,離心機 (德國Eppendorf 公司) ,HJ-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(鞏義市子華儀器有限責任公司) ,顯微鏡 (德國蔡司公司) ,酶標儀DNM-9602G,BIO-RAD電泳槽、Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng) (美國Bio-Rad公司) 。
1.2.1 藥物配制:稱取0.1 g TXL超微粉溶于100 mL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,超聲促溶30 min,5 000g離心10 min,收集上清液,0.22 μ m 微孔濾器過濾除菌,將所得所有沉淀于60 ℃加熱烘干,計算實際溶于培養(yǎng)基的藥物重量,制成TXL母液,分裝后于-20℃貯存?zhèn)溆茫?]。
1.2.2 CFs的原代和傳代培養(yǎng):取生后1~3 d的新生SD大鼠,無菌開胸取心臟,D-Hank’s液洗3次后移至小燒杯,加適量0.08%胰酶后剪成1 mm3碎塊,加入磁力攪拌子,置于恒溫 (37 ℃) 磁力攪拌器上水浴消化。第1次消化10 min,棄上清;以后每次消化8 min,吸取上清至離心管 (預加血清終止消化) ,1 000 r/min離心8 min。棄上清,留取所有離心沉淀,加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞,150目篩網(wǎng)過濾重懸,接種于斜頸培養(yǎng)瓶后置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中差速貼壁1.5 h[5-6]。1.5 h后吸棄培養(yǎng)液 (含有未貼壁的雜質細胞) ,更換含15%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液后于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),以后每2 d更換1次培養(yǎng)液,待細胞長滿后傳代培養(yǎng)。
1.2.3 CFs免疫熒光鑒別:波形蛋白正常情況下表達于成纖維細胞等間質細胞中,在心肌細胞和內皮細胞中不表達,所以可根據(jù)波形蛋白表達陽性來鑒別CFs[7]。取第2代CFs接種于放有無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內,2 d后吸棄培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定,0.1% Triton X-100室溫封閉30 min,5%BSA室溫搖床封閉30 min。加1∶200鼠抗波形蛋白抗體4 ℃過夜。加1∶200 FITC標記的IgG二抗室溫避光孵育30 min。熒光淬滅劑封片,于熒光顯微鏡下觀察。
1.2.4 MTT檢測CFs的增殖活力:
1.2.4.1 高糖培養(yǎng)CFs作用時間的篩選 實驗分為低糖組和高糖組,每組取對數(shù)生長期的CFs接種于96孔培養(yǎng)板中,低糖組用低糖DMEM (葡萄糖濃度5.5 mmol/L) 分別培養(yǎng)6、12、24、48、72 h,高糖組用高糖DMEM (葡萄糖濃度25 mmol/L) 培養(yǎng)至相同時間點,每組各時間點設3個復孔,各組到達相應處理時間點后,加入5 mg/mL的MTT 20 μ L繼續(xù)孵育,4 h后吸去培養(yǎng)液,加入100 μ L DMSO于搖床振蕩10 min,在酶標儀490 nm波長下測定各孔吸光度 (optical density,OD) ,篩選出高糖培養(yǎng)CFs的最佳作用時間。
1.2.4.2 TXL作用于高糖培養(yǎng)CFs的增殖活力檢測按文獻[8]篩選出TXL最佳作用濃度,以最佳作用時間干預,分組如下:對照組 (低糖DMEM培養(yǎng)) 、模型組 (高糖DMEM培養(yǎng)) 、20 μ g/mL TXL組 (高糖DMEM+20 μ g/mLTXL培養(yǎng)) 、80 μ g/mL TXL組 (高糖DMEM+80 μ g/mLTXL培養(yǎng)) 、320 μ g/mL TXL組 (高糖DMEM+320 μ g/mLTXL培養(yǎng)) ,每組設3個復孔,MTT法檢測每組CFs相應時間點的OD值,操作過程同上。
1.2.5 ELISA檢測各組上清中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的含量:CFs以適宜濃度接種于24孔培養(yǎng)板,低糖DMEM培養(yǎng)。待細胞長至70%~80%時,分組并更換各組相應條件培養(yǎng)基,作用24 h后收集各組上清液,按照試劑盒說明用ELISA檢測各組上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的含量。
1.2.6 Western blotting檢測bax和bcl-2蛋白的表達:各組細胞相應條件培養(yǎng)24 h后分別于冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清液,BCA法測定蛋白質含量;取適量上清加入上樣緩沖液充分混合,煮沸10 min,進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 。轉膜1 h,封閉1 h。一抗孵育過夜,TBS-T緩沖液洗脫3次。加入二抗于搖床上室溫孵育1 h,TBS-T緩沖液洗脫3次。ECL顯色,GAPDH為內參,凝膠分析軟件分析各蛋白條帶的OD值。
采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
大部分CFs培養(yǎng)1.5 h后貼壁,細胞成梭形或三角形,均勻散在分布。CFs生長迅速,約2~3 d即呈現(xiàn)融合狀態(tài),細胞增多,胞體增大,細胞排列密集,未見細胞搏動。見圖1。
對第2代CFs進行波形蛋白免疫熒光染色,可見波形蛋白抗原表達呈陽性,符合實驗要求。見圖2。
MTT測得的OD值可以反映CFs的增殖活力。組內比較顯示,低糖組和高糖組的OD值均隨時間逐漸升高,但低糖組于48 h達峰值;而高糖組于24 h達峰值。2組間比較顯示,高糖組各時間點的OD值均高于低糖組,且以24 h最為明顯。說明高糖環(huán)境可以增強CFs的增殖活力,且以作用24 h時的增殖活力最強。見表1。
圖2 CFs免疫熒光鑒定 ×200Fig.2 CFs identification using immunofluorescence ×200
模型組OD值與對照組相比顯著升高 (P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;TXL濃度分別為80 μ g/mL 和320 μ g/mL 的TXL處理組OD值與模型組相比均顯著下降(P均<0.05) ,差異有統(tǒng)計學意義。見表2。
表1 低糖組和高糖組各時間點OD值 (±s)Tab.1 OD values for the low- and high-glucose groups at each time point (±s)
表1 低糖組和高糖組各時間點OD值 (±s)Tab.1 OD values for the low- and high-glucose groups at each time point (±s)
1) compared with the 6 h OD in each group,P < 0.05; 2) compared with the 12 h OD in each group,P < 0.05;3) compared with the 24 h OD in each group, P < 0.05;4) compared with the 48 h OD in each group,P < 0.05;5) compared with the 72 h OD in each group,P < 0.05;6) compared with the low glucose group at the same time point, P < 0.05.
Group n 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h Low-glucose group 3 0.242 1±0.014 93),4),5) 0.289 9±0.021 03),4),5) 0.348 6±0.023 31),2),4) 0.438 5±0.021 91),2),3),5) 0.353 8±0.009 81),2),4)High-glucose group 3 0.296 1±0.023 52),3),4),6) 0.412 6±0.035 31),3),4),6) 0.616 0±0.035 11),2),4),5),6) 0.502 6±0.043 41),2),3),5),6) 0.406 8±0.056 51),3),4)
表2 各組CFs的OD值比較 (±s)Tab.2 OD values for each group (±s)
表2 各組CFs的OD值比較 (±s)Tab.2 OD values for each group (±s)
Group n OD Control group 3 0.346 4±0.023 42),3),4),5)Model group 3 0.619 9±0.020 41),4),5)20 μ g/mL TXL group 3 0.574 3±0.044 11),4),5)80 μ g/mL TXL group 3 0.509 8±0.009 31),2),3),5)320 μ g/mL TXL group 3 0.459 8±0.013 31),2),3),4)
1) compared with the control group,P< 0.05;2) compared with the model group,P< 0.05;3) compared with the 20 μ g/mL TXL group,P< 0.05;4)compared with the 80 μ g/mL TXL group,P< 0.05;5) compared with the 320 μ g/mL TXL group,P< 0.05.
模型組Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量明顯高于對照組 (P< 0.05) ,差異有統(tǒng)計學意義;而TXL濃度分別為20、80、320 μ g/mL 的TXL處理組的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白含量與模型組相比均顯著降低(P均<0.05) ,差異有統(tǒng)計學意義。見表3。
與對照組相比,模型組促凋亡的bax表達減少、抗凋亡的bcl-2表達顯著增加。TXL濃度分別為20、80、320 μ g/mL 的TXL處理組與模型組相比,bax的表達明顯上調、bcl-2表達顯著下調。見圖3。
表3 ELISA檢測各組Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的含量 (±s)Tab.3 Collagen types I and III content in each group,detected by ELISA (±s)
表3 ELISA檢測各組Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的含量 (±s)Tab.3 Collagen types I and III content in each group,detected by ELISA (±s)
Compared with control group,1) P < 0.05;compared with model group,2) P < 0.05;compared with 20 μ g/mL TXL group,3) P < 0.05;compared with 80 μ g/mL TXL group,4) P < 0.05;compared with 320 μ g/mL TXL group,5) P < 0.05.
GroupnTypeⅠcollagen (μ g/L)Type Ⅲ collagen (ng/L)Control group 3 0.774 5±0.247 52),3),4) 184.288 2±24.668 52),3),4),5)Model group 3 6.999 0±0.429 31),3),4),5) 783.407 9±16.847 41),3),4),5)20 μ g/mL TXL group 3 3.879 5±0.388 21),2),4),5) 541.959 0±12.655 51),2),4),5)80 μ g/mL TXL group 3 2.200 3±0.357 01),2),3),5) 438.438 7±10.653 11),2),3),5)320 μ g/mL TXL group 3 1.403 3±0.412 32),3),4) 318.448 7±13.637 11),2),3),4)
TXL是由人參、赤芍、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蟬蛻、蜈蚣、冰片組成的復方制劑。人參皂甙可以促進葡萄糖的有氧氧化和胰島素的釋放,還可通過減少組織內氧自由基、保護線粒體等作用來調控凋亡相關蛋白bcl-2和bax的表達[9];赤芍、水蛭、全蝎、土鱉蟲具有抗凝、抑制血栓形成的功能;蟬蛻、蜈蚣、冰片則具有活血散瘀、通經祛風等功效。近年來,TXL在治療心血管疾病尤其是MF、糖尿病微血管病變等方面已取得良好成效。
圖3 Western blotting檢測各組bax和bcl-2蛋白表達水平Fig.3 Detection of bax and bcl-2 protein expression by Western blotting
鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠在TXL治療后,心臟病變有了明顯改善。心臟的重量指數(shù)明顯降低,左心室收縮壓顯著升高,左心室舒張末壓顯著降低,左心室內壓最大上升速率和左心室內壓最大下降速率都升高,且左心室內壓最大下降速率比左心室內壓最大上升速率升高明顯,表明TXL可以改善糖尿病心肌病大鼠心臟舒縮功能障礙,尤其是舒張功能[10]。TXL還能通過調節(jié)轉化生長因子β、基質金屬蛋白酶9、組織金屬蛋白抑制因子1三者的平衡以及TGF-β/Smad信號通路防治糖尿病大鼠的MF[11]。
本研究是在已有的動物實驗的基礎上,將TXL直接作用于與MF的發(fā)展密切相關的CFs,從細胞學角度進一步探究TXL防治MF的可能機制。CFs在某些病理因素的刺激下可過度增殖并轉化為肌成纖維細胞[12],后者可分泌大量的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白以增加心臟的僵硬度,進而影響心臟的舒縮功能,最終導致MF[13]。糖尿病時體內所形成的高糖環(huán)境是誘發(fā)MF的主要因素之一,其機制主要與氧化應激、晚期糖基化終產物的積累和激活蛋白激酶C有關[14-15]。本研究以高糖培養(yǎng)CFs模擬誘發(fā)MF的病理內環(huán)境,以低糖培養(yǎng)CFs作對照,對比觀察不同劑量TXL干預后CFs的增殖和分泌情況,結果發(fā)現(xiàn),高糖培養(yǎng)可以誘導CFs增殖并增強其分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的能力,而TXL可以抑制CFs在高糖環(huán)境中的增殖,還能減弱膠原蛋白的分泌。CFs的過度增殖也意味著其凋亡程序的減弱,因此,CFs凋亡的減少有可能也是構成MF的重要原因。Bcl-2家族是最重要的凋亡調控基因之一,既含有抗凋亡的bcl-2,又含有促進凋亡的bax,兩者共同調控細胞的凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn),CFs在高糖環(huán)境中bcl-2表達增加、bax表達減少,凋亡減弱;而TXL具有通過降低bcl-2的表達、上調bax的表達未誘導CFs凋亡的作用。
目前,TXL治療MF方面的實驗研究大多以動物實驗為主,而TXL對CFs的作用國內外實驗少有研究和報道。本研究從細胞實驗的角度證實了TXL可以通過抑制高糖環(huán)境中CFs的增殖和分泌,誘導CFs凋亡等途徑發(fā)揮防治MF的作用,這不僅為TXL治療MF提供了新的理論依據(jù),更為糖尿病MF的治療提供了新的思路。
[1] PITT B,ZANNAD F. The detection of myocardial fibrosis:an opportunity to reduce cardiovascular risk in patients with diabetes mellitus?[J]. Circ Cardiovasc Imaging,2012,5 (1) :9-11. DOI:10.1161/CIRCIMAG.111.971143 .
[2] CHACAR S,F(xiàn)ARES N,BOIS P,et al. Basic signaling in cardiac fibroblasts [J]. J Cell Physiol,2017,232 (4) :725-730. DOI:10.1002/jcp.25624.
[3] WANG XM,MU CZ,MU TC,et al. Effects of Tongxinluo on myocardial fibrosis in diabetic rats [J]. J Chin Med Assoc,2016,79 (3) :130-136.
[4] 位庚,劉紅利,李紅蓉,等. 通心絡對同型半胱氨酸誘導大鼠心肌微血管內皮祖細胞損傷的干預作用及氧化應激機制研究[J]. 中國循環(huán)雜志,2016,31 (9) :908-912. DOI:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.09.019.
[5] LIU ZW,ZHANG y,TANG ZG,et al. Matrine attenuates cardiac fibrosis by affecting ATF6 sign aling pathway in diabetic cardiomyopathy [J]. Eur J Pharmacol,2017,804:21-30. DOI:10.1016/j.ejphar.2017.03.061.
[6] 朱占占,侯賓,孫雯雯,等. 慢病毒-基質細胞衍生因子-1α-綠色熒光蛋白載體轉染大鼠心肌成纖維細胞[J]. 解剖學報,2017,48(1):43-47. DOI:10.16098/j.issn.0529-1356.2017.01.008.
[7] 朱曉麗,王麗,馬依彤,等. 乳鼠心肌細胞和心肌成纖維細胞體外分離培養(yǎng)方法的優(yōu)化[J]. 中國動脈硬化雜志,2015,23 (1) :90-93.
[8] 曾和松,劉正湘,馬業(yè)新. 通心絡抑制缺氧誘導的血管內皮細胞凋亡及機制研究[J]. 中國實驗方劑學雜志,2004,10 (3) :27-30.
[9] MA DZ,BAI XC,ZOU HF,et al. Rheb GTPase controls apoptosis by regulating interaction of FKBP38 with Bcl-2 and Bcl-XL [J]. Biol Chem,2010,28 (12) :8621-8627. DOI:10.1074/jbc.M109.092353.
[10] 王小梅,穆長征,趙田田,等. 通心絡對糖尿病大鼠心臟功能及心肌超微結構的影響[J]. 中成藥,2010,32 (12) :2167-2170.
[11] 王小梅,穆長征,楊穎婷,等. 通心絡對糖尿病大鼠心肌纖維化的防治作用[J]. 中國生化藥物雜志,2012,33 (5) :559-562.
[12] 門素珍,馬麗娟,劉巍. 非心肌細胞在心肌肥大和纖維化中的研究進展[J]. 國際心血管病志,2017,44 (1) :18-21. DOI:10.3969/j.issn.1673-6583.2017.01.005.
[13] TANG M,ZHONG M,SHANG y,et al. Differential regulation of collagen typesⅠandⅢexpression in cardiac fibroblasts by AGEs through TRB3/MAPK signaling pathway [J]. Cell Mol Life Sci,2008,65 (18):2924-2932. DOI:10.1007/s00018-008-8255-3.
[14] THANDAVARAyAN RA,GIRIDHARAN VV,WATANABE K,et al. Diabetic cardiomyopathy and oxidative stress:role of antioxidants[J]. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem,2011,9 (4) :225-230.DOI:10.2174/187152511798120877.
[15] FARIA A,PERSAUD SJ. Cardiac oxidative stress in diabete:Mechanisms and therapeutic potential [J]. Pharmacol Ther,2017,172:50-62. DOI:10.1016/j.pharmthera.2016.11.013.
[16] FENG yP,LIU F,DU ZX,et al. Wip1 regulates SKOV3 cell apoptosis through the p38 MAPK signaling pathway [J]. Mol Med Rep,2017,15 (6) :3651-3657. DOI:10.3892/mmr.2017.6469.