柳中洋，盧穎，韓麗英，馬艷萍，齊瑩，黃郁晶，阮強

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室，沈陽 110004； 2. 錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001； 3. 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科，上海 200062）

人巨細(xì)胞病毒 （human cytomegalovirus，HCMV）是引起先天畸形的重要因素之一［1］，分別研究每個基因的功能是揭示其致病機制的有效手段，單個基因的敲除與編輯是基因功能研究的重要方法。細(xì)菌人工染色體 （bacterial artificial chromosome，BAC） 具有拷貝數(shù)低、攜帶外源DNA片段大、易于操作等特點［2］。1999年，BORST等［3］構(gòu)建了第1個HCMV-BAC，BAC成為研究HCMV基因功能的重要技術(shù)，但是BAC技術(shù)可置換HCMV DNA長度的下限尚無報道。LUNA位于復(fù)制必需基因UL80和UL82之間，其轉(zhuǎn)錄本與UL80和UL82的轉(zhuǎn)錄本都有重疊［4］。本研究通過置換突變HCMV-BAC中LUNA轉(zhuǎn)錄起始端短片段，探討了HCMV-BAC技術(shù)在小片段序列置換突變中的應(yīng)用，為HCMV基因小片段的編輯研究提供方法學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

HCMV Han株為中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室保存的臨床分離株，Han株細(xì)菌人工染色體 （Han-BAC） 是病毒研究室與武漢病毒所合作構(gòu)建［5］；人胚肺成纖維細(xì)胞 （human embryonic lung fibroblast，HELF） 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所；DH10B菌種購自美國Invitrogen公司；Dy380菌種，pGEM-oriv/kana2質(zhì)粒和pCDNA3-pp71質(zhì)粒為武漢病毒所贈送。

1.2 方法

1.2.1 置換突變位置的選擇：分析LUNA轉(zhuǎn)錄起始位點附近結(jié)構(gòu)［4］，針對UL80與UL82轉(zhuǎn)錄方向相反的特點，選擇UL80和UL82轉(zhuǎn)錄終止信號“AATAA”之間的31 bp作為置換突變位點，其側(cè)翼各50 bp序列作為同源臂，見圖1。

1.2.2 PCR擴增卡那霉素抗性基因的序列：使用5’末端帶有LUNA同源臂序列的卡那霉素抗性基因特異性引物 （表1） ，以pGEM-oriv/kana2質(zhì)粒作為模板，按照La Taq （日本TaKaRa公司） 推薦的反應(yīng)體系，PCR擴增用于替換LUNA序列的卡那霉素抗性基因?？敲顾乜剐曰蚰┒司哂薪K止密碼子“AATAA”。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。使用Gel and PCR Clean-Up System （美國Promega公司） 純化回收PCR產(chǎn)物，-20 ℃保存。

圖1 LUNA及其附近基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure and sequence of LUNA and its neighboring genes

1.2.3 同源重組置換突變LUNA基因轉(zhuǎn)錄起始端序列：制備含有Han-BAC的Dy380電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌［2］，當(dāng)細(xì)菌增殖至600 nm吸光度達(dá)到0.4時轉(zhuǎn)移到水浴搖床中，42 ℃ 225 r/min，熱誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)15 min。將1 μ g純化的卡那霉素抗性基因片段與100 μ L的感受態(tài)細(xì)菌混合，轉(zhuǎn)移到冰浴的1 mm電轉(zhuǎn)杯中（美國Biorad公司） ，1.8 kV，25 μ F，200 Ω電脈沖處理1次。迅速向電轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中加入800 μ L LB （-） 培養(yǎng)基，32 ℃，225 r/min培養(yǎng)1 h，涂于卡那霉素抗性LB平皿，32 ℃培養(yǎng)30 h。使用PCR方法，利用突變位點外側(cè)的鑒定引物 （表1） 對單克隆菌落進(jìn)行鑒定，選擇擴增鑒定陽性克隆進(jìn)行保種和測序。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化拯救病毒：按照試劑盒推薦程序，使用質(zhì)粒DNA純化試劑盒 （德國MACHEREy-NAGEL公司） 提取LUNAΔ株質(zhì)粒，使用DNA Purification System （美國Promega公司） 提取pCDNA3-pp71質(zhì)粒，使用NanoDrop ND-1000 （美國Thermo Fisher Scientific公司） 檢測質(zhì)粒濃度。使用0.25%的胰酶 （美國Gibco公司） 消化培養(yǎng)成單層的HELF細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/100 μ L。取500 μ L細(xì)胞懸液至預(yù)冷的1.5 mL EP管中，加入LUNAΔ質(zhì)粒5 μ g，pCDNA3-pp71質(zhì)粒1 μ g，吹打混勻后轉(zhuǎn)入冰上預(yù)冷的4 mm電轉(zhuǎn)杯 （美國Biorad公司） 中，260 V，975 μ F，電阻∞，電脈沖處理1次。將電轉(zhuǎn)化的細(xì)胞放回T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使用含有10% FBS （以色列BI公司） 的MEM （美國Hyclone公司） 于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，每3 d換液1次。熒光顯微鏡 （日本尼康公司） 下觀察綠色熒光和細(xì)胞病變效應(yīng) （cytopathic effect，CPE） 情況。待CPE達(dá)到100%時收獲病毒，作為毒種保存。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers used in the study

1.2.5 實時PCR聯(lián)合cDNA克隆測序檢測缺失突變后LUNA、UL80和UL82的轉(zhuǎn)錄情況和轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)：分別使用Han株和LUNAΔ株接種HELF，待病變率＞80%時使用Trizol （美國Invitrogen公司） 收獲感染細(xì)胞，酚-氯仿法抽提總RNA。使用TURBO DNA-freeTMKit （美國Ambio公司） 對總RNA進(jìn)行去DNA處理。使用3’-FULL RACE Core Set with PrimeScript Rtase （日本TaKaRa公司） 試劑盒中的oligo dT將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以基因特異性引物作為上游引物 （表1），oligo dT引入的通用引物作為下游引物，采用巢式PCR分別擴增LUNA、UL80和UL82的mRNA 3’端序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過切膠純化，TA克隆到PCR2.1載體（美國Invitrogen公司） 后進(jìn)行測序。使用Bioedit軟件比對Han與LUNAΔ株的測序結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 缺失突變結(jié)果

缺失突變后挑取32個單克隆菌落進(jìn)行PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其中1個菌落的鑒定結(jié)果顯示，目的片段被卡那霉素抗性片段成功替換，見圖2A。測序結(jié)果顯示，該菌落中的Han-BAC 的LUNA目的片段完全按照預(yù)期缺失，缺失位點側(cè)翼的UL80和UL82基因結(jié)構(gòu)未受影響，見圖2B。

圖2 缺失突變克隆鑒定Fig.2 Identification of the mutated clones

2.2 病毒拯救與病毒活力檢測結(jié)果

電轉(zhuǎn)化拯救10 d后出現(xiàn)HCMV典型CPE，熒光顯微鏡下可見來自于病毒表達(dá)的綠色熒光蛋白信號，說明LUNAΔ株成功包裝成病毒顆粒，并且具有感染細(xì)胞的能力，見圖3。

圖3 LUNAΔ株拯救結(jié)果 ×200Fig.3 The rescue result of LUNAΔ strain ×200

2.3 實時PCR與cDNA克隆測序結(jié)果

在LUNAΔ株 感 染 的HLEF中，UL80與UL82轉(zhuǎn)錄正常 （圖4A） 。野生Han株與LUNAΔ株感染的HELF中均未檢測到明確的LUNAmRNA轉(zhuǎn)錄。實時PCR產(chǎn)物測序分析結(jié)果顯示，盡管突變株在置換突變后導(dǎo)致終止信號“AATAA”之后的序列發(fā)生了改變，但UL80與UL82仍然在既定位置切割并且添加了polyA尾 （圖4B） ，其轉(zhuǎn)錄本3’末端結(jié)構(gòu)完整。電泳中不符合預(yù)期產(chǎn)物長度的其他條帶，經(jīng)測序證實均為非特異擴增產(chǎn)物。

3 討論

在病毒基因功能研究方面，突變待研究的病毒基因是最具說服力的實驗證據(jù)。采用BAC技術(shù)進(jìn)行特定病毒基因突變具有諸多優(yōu)勢。在既往使用Han-BAC進(jìn)行病毒基因突變時，均將目的基因完全替換，目的片段與進(jìn)行替換的卡納那霉素抗性基因片段長度相近，同源置換的空間阻力較小，成功率較高。由于HCMV的部分基因存在重疊，缺失突變掉過大的片段可能會造成臨近基因結(jié)構(gòu)的破壞，解決基因小片段突變勢在必行。目的片段的縮短使2個同源重組位點彼此靠近，導(dǎo)致卡那霉素抗性基因兩翼的同源臂捕獲靶位點的阻力增大，同源重組的效率可能明顯下降。能否以較大的卡那霉素抗性基因重組置換小片段的病毒基因序列尚無報道，Han-BAC系統(tǒng)可替換的病毒基因片段的下限也不清楚。

本研究以Han-BAC為基礎(chǔ)，使用同源重組技術(shù)，成功以1 938 bp的卡那霉素抗性基因替換了31 bp 的LUNA轉(zhuǎn)錄起始端序列。在插入的卡那霉素抗性基因末端存在轉(zhuǎn)錄終止信號AATAA，可以阻斷LUNA啟動子與其編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄啟動關(guān)系。這一結(jié)果表明，使用Han-BAC可以實現(xiàn)小至31 bp序列的有效置換。以小片段置換突變?yōu)榛A(chǔ)，同時通過在卡那霉素抗性基因引物與同源臂上之間引入啟動子、終止信號、終止密碼子等序列［6］來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，對于缺少足夠空間進(jìn)行大片段缺失的基因是一個可行的解決方法。

除了本研究所采用的BAC技術(shù)可以進(jìn)行病毒基因突變以外，現(xiàn)有的galk系統(tǒng)也可以實現(xiàn)小片段缺失突變。該系統(tǒng)在體外構(gòu)建好含有目的突變位點的打靶序列，經(jīng)過兩重同源重組與篩選過程，使用打靶序列替換目的序列，并且沒有外源基因殘留［7］。在某些情況下，如果單次缺失突變即可達(dá)到目的，可以有效節(jié)省時間與成本。本研究結(jié)果顯示，在目的片段縮小到31 bp的條件下，缺失突變的效率仍然達(dá)到3%以上，可以滿足實驗需要。通過在制備感受態(tài)過程中提高重組酶的表達(dá)量，預(yù)期可以進(jìn)一步提高重組效率。

本研究中，使用實時PCR技術(shù)在未突變的Han株感染的HLEF細(xì)胞中沒有檢測到LUNA轉(zhuǎn)錄本。分析其原因認(rèn)為，LUNA的表達(dá)量低［8］導(dǎo)致PCR擴增難以得到單一產(chǎn)物；同時LUNA是潛伏感染相關(guān)基因，裂解感染狀態(tài)下其轉(zhuǎn)錄可能受到抑制。即便如此，對突變病毒株進(jìn)行DNA測序的結(jié)果依然表明，使用BAC技術(shù)可以成功置換小片段序列，而這一突變對臨近基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)沒有影響，提示相關(guān)技術(shù)可以用于病毒基因小片段的缺失突變和有關(guān)基因功能的研究。

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