劉 勇 周 彪 曾 金 劉華寶

(重慶市中醫(yī)院肝病科，重慶 400020)

雖然肝癌發(fā)病的分子機制目前尚不清楚，但已有研究表明免疫細胞及細胞因子在肝癌發(fā)病中發(fā)揮重要作用〔1〕。輔助性T細胞(Th)17和調節(jié)性T細胞(Treg)同屬于CD4+T細胞亞群，CD4+T細胞在白細胞介素(IL)-6和轉化生長因子(TGF)-β的共同誘導下分化為Th17細胞，Th17細胞可特異性分泌IL-17因子，通過與其受體結合進而發(fā)揮促炎癥作用〔2〕。CD4+T細胞在TGF-β的誘導下可分化為Treg細胞，Treg細胞通過分泌IL-10和TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用〔3〕。Th17細胞和Treg細胞在分化過程中關系密切，在腫瘤患者中，Th17細胞和Treg細胞存在失衡現(xiàn)象〔4，5〕。目前關于Th17/Treg細胞及相關細胞因子的失衡在肝癌中的研究較少報道，因此本研究檢測Th17/Treg細胞及IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β細胞因子在肝癌患者及正常對照人群血漿中的表達，并在肝癌細胞系中探討IL-17對肝癌細胞侵襲能力的影響及其作用機制。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取住院的40例肝癌患者作為觀察組，其中男23例，女17例，年齡31～72〔平均(57.1±2.3)〕歲。選取同期進行健康體檢的40例正常人作為對照組，其中男21例，女19例，年齡32～74〔平均(57.9±2.5)〕歲。兩組患者在年齡和性別分布上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)有可比性。

1.2流式細胞術檢測外周血中Th17和Treg細胞比例 吸取1 ml外周血，與等量的RPMI1640培養(yǎng)基混合均勻，然后加入佛波酯(50 ng/ml)、離子霉素(1 μg/ml)和莫能霉素(2 μg/L)，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中刺激4 h。PBS洗滌后加入CD4單抗(江蘇凱基生物技術股份有限公司)，混勻后室溫避光孵育30 min。PBS洗滌，每管混合液加入2 ml溶血素，室溫避光孵育10 min以裂解紅細胞，PBS洗滌后離心棄上清液。加入破膜緩沖液，室溫避光孵育10 min，離心棄上清。Th17細胞加入抗人IL-17單抗(eBioscience公司)，Treg細胞加入抗人Foxp3單抗(eBioscience公司)，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次，加入500 μl PBS重懸細胞，上機檢測。

1.3酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測細胞因子表達水平 將空腹抽取的1 ml外周血置于EDTA抗凝管中，然后離心(3 000 r/min，5 min)，分離血漿，置于-80℃冰箱待用。IL-17，IL-10，IL-6和TGF-β ELISA檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術股份有限公司(IL-17：KGEHC170；IL-10：KGEHC009(H)；IL-6：KGEHC007-1；TGF-β：KGEHC107B)，實驗步驟嚴格按照說明書進行操作，將待檢血清按1∶10進行稀釋后加入已包被的反應孔中，37℃孵育1 h后洗滌，加入100 μl酶標抗體，37℃孵育1 h后洗滌，加入酶標二抗，37℃孵育1 h后洗滌，加入顯色液避光孵育30 min，待反應終止后用BioRad酶標儀檢測在450 nm處的吸光值。

1.4細胞轉染 人肝癌細胞系SMMC7721購自上海中科院細胞庫(上海，中國)，細胞培養(yǎng)液包含RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL，NY，USA)，10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和鏈霉素(Gibco-BRL)。細胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2，95%濕度的培養(yǎng)箱中。轉染前一天取對數(shù)生長期的細胞，胰酶(Gibco-BRL)消化并吹打成單個細胞，接種至6孔板，每孔約1×105個細胞，培養(yǎng)過夜，觀察細胞匯合率，在70%～90%時，采取Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific，MA，UAS)轉染IL-17 siRNA(5′-CCTCAAAGCTCAGCGTGTC-3′)及陰性對照(5′-UAGCGACU AAACACAUCAAUU-3′)(上海吉瑪制藥技術有限公司，上海，中國)，6 h后換液，48 h后提取RNA和蛋白質，檢測沉默效率。

1.5實時熒光定量PCR檢測細胞因子表達(qRT-PCR) 使用Trizol(Thermo Fisher Scientific)裂解轉染后的SMMC7721細胞，提取總RNA，定量后將1 μg RNA逆轉錄(Takara，大連，中國)為cDNA，產物保存于-20℃冰箱備用。引物序列：IL-17，正鏈5′-TCAACCGTTCCACGTCACCCTGGAC-3′，負鏈5′-TCAGCATTCAACTTGAGCTCTCATGC-3′〔6〕；基質金屬蛋白酶(MMP)-2：正鏈5′-AAGTCTGAA-GAGCGTGAAGTTTGG A-3′，負鏈5′-TGAGGGTTGGTGGGATTGGAG-3′；MMP-9：正鏈5′-AGTCCACCCTTGTGCTCTTCCC-3′，負鏈5′-TCTGCCACCCGAGTGTAACCAT-3′；β-actin，正鏈5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′，負鏈5′-GTCATA CTCCTGCTTGCTGAT-3′〔7〕。以β-actin作為內參。基因相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。所有qRT-PCR實驗n=3。

1.6免疫印跡(Western blot)檢測蛋白水平 將轉染48 h后的細胞置于細胞裂解液裂解10 min，13 000 r/min 離心5 min后吸取上清。聚丙烯酰胺凝膠電泳30 μg 蛋白，后250 mA轉膜1 h，將蛋白置于聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后加入一抗：IL-17(1∶1 000，CST公司，MA，USA)，MMP-2(1∶500，CST公司)，MMP-9(1∶500，CST公司)，β-actin(1∶8 000，sigma公司，MO，USA)。4℃孵育過夜，TBST洗滌6×10 min后加入HRP標記的二抗(1∶2 000，中杉金橋，北京，中國)，室溫孵育2 h，TBST洗滌9×10 min后，電化學發(fā)光法(ECL)顯色，暗室壓片后在洗片機上曝光顯影。

1.7Transwell法檢測細胞侵襲能力 細胞轉染24 h后，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)8 h。消化細胞，配成無血清細胞懸液；基質膠用無血清RPMI1640培養(yǎng)基1∶5稀釋，加入上層小室，置于37℃培養(yǎng)箱使之凝固。然后將Transwell小室置于24孔板內，每個小室加入100 μl無血清細胞懸液(約3×105個細胞)，下室加入600 μl完全RPMI1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h，取出Transwell小室，PBS清洗后用棉棒擦去小室上層的細胞，PBS再次清洗以去除上層細胞；在小室的下層加入600 μl 0.1%的結晶紫染液，染色10 min，洗滌后風干，使用UFX-ⅡA型顯微鏡(日本Olympus)拍照，在高倍鏡下隨選取10個視野計數(shù)。

1.8統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組外周血中Th17/Treg細胞變化 觀察組外周血中Th17 細胞和Treg細胞比例顯著高于對照組，Th17/Treg比例顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2兩組外周血中IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β細胞因子變化 觀察組外周血中IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β表達水平均顯著高于對照組(均P<0.05)。見表2。

2.3IL-17沉默效果檢測 轉染IL-22 siRNA后SMMC7721細胞系分泌的IL-17及細胞內表達的IL-17水平較陰性對照組顯著降低(P<0.05)。見表3、圖1。

2.4沉默表達IL-17對肝癌侵襲能力的影響 Transwell結果顯示，沉默IL-17后SMMC7721細胞侵襲能力(0.19±0.03)與陰性對照組(1.00±0.01)相比顯著降低(t=62.742,P<0.05)。見圖2。

2.5干擾IL-17對肝癌細胞MMP-2和MMP-9表達影響 沉默IL-17后，MMP-2和MMP-9表達明顯降低(P<0.05)，見表4、圖3。

表1 兩組外周血Th17/Treg細胞比例

表2 兩組外周血中細胞因子的表達

表3 沉默IL-17后表達水平比較

圖1 沉默IL-17后表達水平檢測

圖2 沉默IL-17后肝癌侵襲能力檢測(Transwell法)

組別MMP-2MMP-9SMMC7721轉染沉默后0.47±0.020.60±0.01陰性對照1.00±0.011.00±0.01t/P值58.059/0.00069.282/0.000

圖3 沉默IL-17后MMP-2和MMP-9表達水平檢測

3 討 論

乙型肝炎病毒感染是導致肝癌產生的主要危險因素，機體感染乙肝病毒后，免疫系統(tǒng)產生抗病毒反應，清除病毒的同時引起了肝細胞損傷，肝細胞反復的壞死和再生導致肝癌的發(fā)展〔6，7〕。乙型肝炎病毒感染引起的慢性炎癥反應是導致肝癌發(fā)生和發(fā)展的主要因素〔8〕。盡管乙肝病毒感染與肝癌的發(fā)展之間的因果關系已經確定，但乙肝病毒誘發(fā)肝癌發(fā)生過程中免疫細胞和細胞因子的作用機制目前尚不明確。前期研究表明，在急性乙肝患者外周血中，Th17 細胞和Treg細胞比例升高且其水平與肝功能有相關性〔9〕。而在肝癌中，有研究報道Th17/Treg 平衡與患者預后密切相關〔10〕。原發(fā)性肝癌患者手術后外周血中高水平的IL-17可增加患者早期復發(fā)的風險〔11〕。

本研究結果顯示，肝癌患者外周血中Th17 細胞和Treg細胞較正常人群上升，Th17/Treg比例較正常人群下降同時IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β表達水平均高于正常人群。這一結果表明這些細胞因子的共同作用可能誘導Th17 細胞和Treg細胞的分化并導致了Th17/Treg的失衡。Th17/Treg失衡將無法控制機體免疫反應，從而導致相應的免疫性損害。同時Th17 細胞比例增加導致其分泌的細胞因子IL-17增加，IL-17可促進某些血管源性細胞因子表達以及腫瘤微血管生成，與腫瘤的生長、轉移和浸潤存在關系〔12〕。異常增加的Treg細胞則可破壞CD8+T細胞的抗腫瘤效應，同時其分泌的細胞因子可以破壞其他免疫殺傷機制，導致肝癌細胞增加〔13〕。本研究表明Th17/Treg及細胞因子失衡與肝癌發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。

本研究還顯示IL-17在RNA水平及蛋白水平顯著下降。Transwell實驗結果表明，沉默IL-17后細胞侵襲能力明顯下降，提示IL-17可能參與肝癌的發(fā)展過程。沉默IL-17抑制了MMP-2和MMP-9的表達，表明IL-17可能通過調控MMP-2和MMP-9進而影響肝癌細胞的侵襲能力。

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