閔 睿

(東北大學醫(yī)院內(nèi)科，遼寧 沈陽 110819)

糖尿病腎病(DN)是終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要原因，DN的早期表現(xiàn)是腎臟體積增大，腎小球濾過增加，組織學改變是腎小球系膜基質(zhì)增生，腎小管基底膜增厚等〔1，2〕。到目前為止，發(fā)病機制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、趨化因子、各種生長因子、TNF-α等細胞因子介導(dǎo)的炎癥機制是DN發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵〔3，4〕。丹紅注射液是一種由丹參、紅花等傳統(tǒng)中藥經(jīng)科學配方加工而成的復(fù)方注射液，中醫(yī)學認為丹參性寒味苦，為君藥；而紅花性溫味辛，為臣藥〔5〕，有活血化瘀，通脈舒絡(luò)的功效，被廣泛應(yīng)用于心絞痛、腦梗死及冠心病等心腦血管疾病的治療。研究表明，丹紅注射液在藥理作用方面有抑制炎癥反應(yīng)的功能〔6〕。本研究通過用丹紅注射液干預(yù)DN，觀察實驗動物的腎功能指標及TGF-β1和MMP-2的表達變化，探討其在DN發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物造模、分組 48只8周齡雄性SD大鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心，體重200～250 g，鼠齡60～65 d。飼養(yǎng)中自由飲水攝食，飼料為含5%脂肪的普通飼料，SPF級，經(jīng)輻照滅菌，并且飲用水及墊料均經(jīng)高壓滅菌后使用，每日更換墊料。室溫為21℃～23℃，照明時間為12 h。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，采用隨機數(shù)字表法抽取12只為正常對照組，其余為糖尿病造模組。造模前稱體重，造模組大鼠一次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，用1%檸檬酸鹽緩沖液配制成5%的溶液，pH4.5，給藥劑量55 mg/kg。正常對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。72 h后，尾靜脈取血測得空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L，持續(xù)3 d為造模成功。將造模成功的糖尿病大鼠隨機分成3組，每組12只，分別為糖尿病對照組、丹紅注射液干預(yù)組及二甲雙胍治療組。其中正常對照組及糖尿病對照組在實驗過程中每日腹腔注射蒸餾水2 ml/kg，丹紅注射液干預(yù)組每日腹腔注射丹紅注射液2 ml/kg，二甲雙胍治療組用蒸餾水配制(300 mg/kg)并灌胃。所有組別連續(xù)治療8 w，每周稱大鼠體重，于8 w末采集標本。

1.2血、尿標本采集及檢測 在第8周末給藥后將大鼠放入代謝籠留取24 h尿標本，計算尿量后，3 000 r/min離心10 min，取上清，用全自動生化分析儀(日立，7170A)檢測尿蛋白量，采用一點終點法，標本量4 μl，試劑量(尿總蛋白自動分析試劑，randox)240 μl，波長600 nm，反應(yīng)時間5 min后比色測定。在520 nm波長采用比濁法測定(722分光光度計) 尿肌酐，24 h尿蛋白定量=尿總蛋白/尿肌酐。大鼠禁食8 h后用10%水合氯醛麻醉，從腹主動脈取血液標本，3 000 r/min離心10 min，取血清，均采用全自動生化分析儀(Olmpus，AU2700)檢測FPG、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平。取左腎，用10%多聚甲醛固定，待做HE染色及免疫組化。

1.3腎組織HE染色 取8 mm3腎組織用10%中性甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度2.5 μm，脫蠟至水，蘇木素染色5 min，蒸餾水洗，1%鹽酸乙醇分化，蒸餾水洗，1%氨水反藍，蒸餾水洗，伊紅染色10 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片。

1.4免疫組化檢測組織中TGF-β1和MMP-2的含量 采用SP法進行染色。將石蠟切片脫蠟至水，用3%H2O2孵育10 min，加入5%的正常山羊血清，室溫孵育10 min，倒去血清，與特異性抗體孵育：TGF-β1(1∶50，兔抗人，購自Santa Cruz公司)，MMP-2(1∶100，購自Santa Cruz公司，小鼠抗人)，加完一抗后于4℃冰箱中保存過夜，取出用PBS洗滌3遍，每次5 min，加入二抗后置于37℃孵箱中孵育30 min，然后用PBS洗滌3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記物，37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，DAB顯色，清水清洗后蘇木素復(fù)染，清洗，脫水，透明，封片。

1.5RT-PCR檢測TGF-β1/MMP-2 mRNA表達 取100 mg腎組織提取總RNA，試劑盒為RNeasy mini tissue kit(Qiagen，USA)，采用碧云天的試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-20℃保存。GAPDH引物為前向(5′-3′)GGACCAGGTTGTCTCCTGTG，反向(5′-3′)ATTCGAGAGAAGGGAGGGCT；TGF-β1前向(5′-3′)TACCAACTACTGCTTCAGCTCCAC，反向(5′-3′)GTTGTGTTGGTTGTAGAGGGCA；MMP-2前向(5′-3′)GAACACAGCCTTCTCTTCCT，反向(5′-3′)GTTTATTTGGCGGACAGTGAC ，95℃ 10 min，95℃ 15 s，40個循環(huán)，61℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s；PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，采集圖像，用凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，ChemiDoc MP)對結(jié)果進行分析，相對表達量=目的產(chǎn)物/GAPDH的比值。

1.6統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS14.0軟件，多組比較采用單因素方差分析，兩個時點觀測資料采用單因素方差-協(xié)方差分析，組間兩兩比較采用HSD-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組血糖和體重比較 考慮到各組0 w數(shù)據(jù)不盡相同，故以其為協(xié)因素進行協(xié)方差分析，對8 w數(shù)據(jù)進行校正。到第8周末，各組大鼠血糖和體重整體差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來看，體重指標：3個造模組低于正常對照組，而3個造模組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；血糖：3個造模組較正常對照組明顯升高(P<0.05)，其中二甲雙胍治療組低于糖尿病對照組(P<0.05)，而糖尿病對照組與丹紅注射液干預(yù)組之間大鼠的血糖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 實驗8 w各組血糖和體重比較

2.2各組血生化指標比較 由整體分析(單因素方差分析)可知：四項生化指標的四組間整體差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來看：3個造模組TC、TG較正常對照組明顯升高(P<0.05)，其中丹紅注射液干預(yù)組及二甲雙胍治療組大鼠的TC、TG較糖尿病對照組明顯降低(P<0.05)；BUN和SCr水平在各組之間也表現(xiàn)出同樣的趨勢。見表2。

表2 各組血生化指標比較

2.3各組大鼠24 h尿量及尿蛋白比較 4組間尿量及尿蛋白整體差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來看：3個造模組24 h尿量明顯高于正常對照組(P<0.05)，但是造模組之間差異多無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；尿蛋白較正常對照組明顯升高(P<0.05)，其中丹紅注射液干預(yù)組和二甲雙胍治療組大鼠較糖尿病對照組明顯下降(P<0.05)。見表3。

表3 各組24 h尿量、尿蛋白比較

2.4腎組織HE染色 3個造模組大鼠的腎小球肥大增生，還有部分腎小管細胞出現(xiàn)了空泡樣變性，腎小囊的囊腔縮小，其中丹紅注射液干預(yù)組和二甲雙胍治療組腎組織病變程度較糖尿病對照組有改善。見圖1。

圖1 腎組織HE染色圖(×400)

2.5TGF-β1和MMP-2 mRNA水平比較 整體分析4組TGF-β1和MMP-2 mRNA水平差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來看：3個造模組腎組織中TGF-β1 mRNA較正常對照組明顯增高(P<0.05)，其中丹紅注射液干預(yù)組及二甲雙胍治療組中TGF-β1表達量相對糖尿病對照組減少(P<0.05)；3個造模組腎組織中的MMP-2水平較正常對照組明顯降低(P<0.05)，其中丹紅注射液干預(yù)組及二甲雙胍治療組MMP-2 mRNA水平相對糖尿病對照組增加(P<0.05)；TGF-β1和MMP-2的表達量在丹紅注射液干預(yù)組及二甲雙胍治療組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組TGF-β1和MMP-2 mRNA水平比較

2.6免疫組化檢測TGF-β1和MMP-2蛋白含量 3個造模組TGF-β1表達強度明顯強于正常對照組，其中丹紅注射液干預(yù)組及二甲雙胍治療組的TGF-β1表達強度相對糖尿病對照組明顯減弱，丹紅注射液干預(yù)組及二甲雙胍治療組之間相近。MMP-2表達強度與TGF-β1相反，3個造模組相對正常對照組表達明顯減少，其中丹紅注射液干預(yù)組與二甲雙胍治療組MMP-2表達強度明顯較糖尿病對照組增強，丹紅注射液干預(yù)組及二甲雙胍治療組之間相近。見圖2。

圖2 各組TGF-β1和MMP-2蛋白表達的免疫組化圖(×400)

3 討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模組大鼠的血糖明顯升高，并且有多飲、多食、多尿、體重下降等表現(xiàn)，說明造模成功，而丹紅注射液在降血糖方面無明顯作用。

糖尿病對大鼠的脂代謝有影響，在本研究中，造模組大鼠存在脂代謝異常，而丹紅注射液干預(yù)組的TC、TG較糖尿病對照組明顯降低，提示經(jīng)丹紅注射液治療后，脂代謝紊亂得到了一定程度的改善，與Li等〔7，8〕相關(guān)研究一致。從本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液在糖尿病的進程中能有效保護腎臟功能，但其對腎臟的保護機制還不是十分明確。丹紅注射液是一種良好的微循環(huán)改善劑，在DN中能減少尿蛋白的排泄，有效延緩DN的發(fā)展。丹紅注射液在很多疾病的治療中被發(fā)現(xiàn)有抑制IL-6、TNF-α、MCP-1表達的作用，顯示其有抗炎性損傷的作用〔9〕。在本研究中，大鼠的血生化指標和腎臟HE染色也驗證了這一點，通過PCR和免疫組化實驗從兩個層面說明丹紅注射液有效抑制了TGF-β1的過度表達，但是血糖水平?jīng)]有明顯改善，提示丹紅注射液對腎臟的保護作用可能是通過抑制TGF-β1的表達。而TGF-β1在致腎臟纖維化過程中發(fā)揮著重要的作用，可刺激膠原蛋白的表達，促進細胞外基質(zhì)的表達，也可以抑制促纖溶酶原激活物抑制劑的活性，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和膜型MMPs的活性，通過這幾種途徑降低細胞外基質(zhì)的降解。MMPs在維持腎臟內(nèi)細胞外基質(zhì)的生成與降解平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用〔10,11〕，其中MMP-2可以降解細胞外基質(zhì)的主要成分Ⅳ型膠原〔12〕。在本研究中，丹紅注射液可以促進MMP-2表達，從而減少細胞外基質(zhì)在腎小球系膜區(qū)沉積，減輕腎小球的硬化程度。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DN的發(fā)生發(fā)展可能與TGF-β1過度表達和MMP-2表達降低有關(guān)，并且丹紅注射液可以通過抑制TGF-β1和促進MMP-2表達改善糖尿病大鼠腎功能。

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