周亞凈 劉建敏 魏淑明 張云豪 曲振華 陳樹波

(河北醫(yī)科大學附屬邢臺市人民醫(yī)院麻醉科，河北 邢臺 054001)

隨著工業(yè)化程度的發(fā)展愈發(fā)迅速，人們脊髓損傷的臨床發(fā)病率也呈現(xiàn)出上升的趨勢，而脊髓損傷的預后一般較差，且具有很高的致殘率。臨床工作的難點在于如何最大程度修復脊髓損傷，以達到肢體功能康復的目的，提升患者的生存質量及生存率，減少死亡率〔1～3〕。丙泊酚臨床應用多為全身麻醉的誘導和維持，但經(jīng)過已進行的研究表明，其對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷也能起到一定保護作用〔4～6〕。臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)作為干細胞中應用前景廣泛的一類，經(jīng)過一定條件的誘導，分化為不同的組織細胞，也有一定概率分化為神經(jīng)元細胞，為治療脊髓損傷展示了新的思路〔7～10〕。因此本研究將單獨移植人UC-MSCs、單獨應用丙泊酚及聯(lián)合使用UC-MSCs和丙泊酚應用于脊髓損傷模型的治療，觀察其對脊髓損傷的作用及對肢體功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑 在濰坊醫(yī)學院附屬益都中心醫(yī)院其足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，70只成年雌性，體重200～250 g健康的SD大鼠〔許可證號SCXK(冀)20080010〕，購自河北省實驗動物中心；L-DMEM培養(yǎng)基為美國GibcoBRL公司產(chǎn)品；從美國ThermoForma公司購買細胞培養(yǎng)箱，上海信然生物技術有限公司)提供的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，粉劑，pH7.2)；依地酸二鈉鈣(EDTA，天津市化學試劑一廠)；胰蛋白酶(GibcoBRL公司)；胎牛血清(FBS)(Hyclone公司產(chǎn)品)。CM-Dil、谷氨酞胺(美國Sigma公司)；從美國SantaCruz公司購買的辣根過氧化物酶(HRP)。

1.2UC-MSCs的培養(yǎng)及鑒定 經(jīng)過倫理委員會的批準，本實驗收集足月剖腹產(chǎn)胎兒的臍帶組織若干，去除血管后，0.1%Ⅱ型膠原酶，剩余的間質組織切割成大約直徑為1 mm3組織塊，將處理好的組織塊收集，胰酶(0.25%濃度)以2倍體積被加入予以充分消化30 min。離心后留存下來的細胞及組織，被接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，加入DMEM培養(yǎng)基及5% FBS進行培養(yǎng)。首次傳代后每3天按1∶3的比例傳代，實行擴增培養(yǎng)。提取P3代細胞，消化后加人相應對照標記及PEFITC標記的CD73、CD105、CD31、KDR、CD34、VWF、CD45、HLA-DR、CD235a流式抗體，經(jīng)流式細胞儀檢測。

1.3CM-Dil標記UC-MSCs 提前將CM-Dil液用專用的稀釋劑稀釋，然后在1 ml DMEM培養(yǎng)基(含有5% FBS)中加入稀釋過的CM-Dil液5 μl，此操作過程需要完全避光。將混合后的標記液加入上述UC-MSCs的培養(yǎng)皿中，濃度為40 μl/cm2，加入標記液后的UC-MSCs細胞(融合度達到80%以上)繼續(xù)被放入恒溫37℃培養(yǎng)樣孵育20 min。標記過程結束后，將標記液吸出丟棄，用PBS清洗3次，加入完全培養(yǎng)基(DMEM 9.5 ml+0.5 ml FBS)清洗3次，再繼續(xù)用上述完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。熒光顯微鏡被應用于觀察UC-MSCs被CM-Dil標記的情況，吸取適量傳代時制成的UC-MSCs單細胞懸液用以加入流式細胞儀，通過對細胞懸液的檢測得出CM-Dil的標記率。

1.4動物模型的建立及分組 在正式實驗前將所有SD大鼠制成脊髓損傷模型。所有大鼠從購買來后在實驗室適應性飼養(yǎng)14 d，全部稱重后將其麻醉，麻醉藥物選用10%水合氯醛溶液，麻醉濃度為350 mg/kg，將大鼠以俯臥位固定四肢于操作臺上，麻醉方式為腹腔注射給藥。大鼠背部被完整備皮后，沿著脊柱逐層切開背部皮膚，完全暴露出T7～T10，硬膜保持完整的前提下去除部分T8～T9的棘突和椎板。接下來將10 g重物從2.5 cm高處落下砸擊大鼠暴露出來的硬膜及脊髓組織(改良Allen法)〔11，12〕?？p合后待大鼠恢復意識后繼續(xù)放回籠中飼養(yǎng)，造模成功的標志是大鼠出現(xiàn)雙下肢癱瘓，相應運動功能評分為0，并伴隨有尾巴痙攣擺動。造模成功64只SD大鼠，死亡6只，成功造模的SD大鼠被隨機分為對照組、UC-MSCs組、丙泊酚組、聯(lián)合組各16只。造模6 d后，對照組注射1 ml純DMEM培養(yǎng)基，UC-MSCs移植組注射1 ml UC-MSCs細胞懸液(細胞數(shù)3×106個/L)，丙泊酚組利用尾部留置針連續(xù)4 h注射丙泊酚溶液(2 ml·kg-1·h-1)，聯(lián)合組的處理是在注射與UC-MSCs移植組相同劑量的細胞懸液后與丙泊酚組一起通過尾部留置針連續(xù)注射預制好的丙泊酚溶液(2 ml·kg-1·h-1)。

1.5下肢運動功能評價 應用斜板試驗、Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分〔13～16〕，造模前1 d及造模后1、3 d、1、2、3、4 w，一共測評6次，每次評價均從上午8：00開始，由兩人合評后取平均分。

1.6HE及熒光顯微鏡觀察 隨機從每組中選取5只造模4 w的脊髓損傷模型大鼠，麻醉方式與上述一致，然后暴露出所選擇出的所有模型SD大鼠脊髓損傷的部位，約1 cm脊髓損傷區(qū)域的組織被分別取出，加入提前預制好4%的甲醛予以充分固定，固定好后將其用石蠟包埋并制作成切片，分別被用于HE染色和免疫組織化學。將切片進行二甲苯脫蠟處理，然后予以從高到低的乙醇水合，2 min的水洗后再加以蘇木素予以充分染色5 min，再次水洗后加入鹽酸乙醇分化，弱氨水反藍后水洗再將伊紅染液應用于切片染色15 min。再次通過梯度乙醇溶液脫水處理，加入二甲苯使其透明，封片時采用中性樹脂。光學顯微鏡被應用于脊髓損傷的情況，CM-Dil標記的陽性細胞數(shù)則是使用熒光顯微鏡觀察。

1.7體感誘發(fā)電位(SEP)和運動誘發(fā)電位(MEP)的檢測 再次隨機從各組抽出5只模型大鼠，分別于造模后及傷后4 w予以10%水合氯醛將其麻醉后固定四肢，檢測其MEP和SEP〔17〕。SEP將電極放于頭皮下后肢皮層感覺區(qū)后方約0.5 cm處，給予電流刺激(直流方波)，頻率為3 Hz，波寬為0.2 ms，強度為5～15 mA疊加次數(shù)為50～60次。MEP：將電極放置于大腦皮質運動區(qū)，強度為40 mA，波寬為0.1 ms，頻率為1 Hz，掃描速度為5 ms/D，疊加次數(shù)為300～500次，靈敏度為5 μV/D。對電流刺激后的幅度和相應誘發(fā)電位潛伏期被詳細記錄。

1.8HRP逆行神經(jīng)示蹤 隨機從各組抽出5只模型大鼠，麻醉后部分暴露脊椎，注射用生理鹽水溶解HRP。采用留置針進針，溶解后的HRP溶液以0.1 μl/10 min的速度注射，注射1 μl HRP完畢后，繼續(xù)留針15 min再拔針。做好相應標記，繼續(xù)將本次抽選的所有SD大鼠放回籠中飼養(yǎng)3 d。3 d后將注射過HRP的大鼠取出麻醉后留取脊髓組織予以冰凍切片，再應用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)加強染色法。每組隨機抽取10張切片，對切片上HRP陽性神經(jīng)纖維束進行計數(shù)。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1UC-MSCs形態(tài)學觀察 UC-MSCs接種到培養(yǎng)皿并加入含有5% FBS的培養(yǎng)基第4天，細胞貼壁數(shù)顯著增多，貼壁在皿底的細胞形態(tài)大部分呈現(xiàn)出單一的長梭形，部分形成集落。培養(yǎng)至第9天時，培養(yǎng)皿底部細胞融合度達到90%以上，出現(xiàn)旋渦狀細胞集落。流式細胞儀被應用于UC-MSCs細胞標記率的檢測，結果顯示CD90(90.7%)，CD49(84.9%)，CD29(99.4%)，CD105(92.2%)陽性，被CM-Dil標記后的細胞標記率達100%。熒光顯微鏡觀察下培養(yǎng)皿中的UC-MSCs，鏡下可見標記后的UC-MSCs呈現(xiàn)出紅色熒光，見圖1。

2.2下肢運動功能評價結果 造模前4組SD大鼠的斜板試驗、BBB評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，造模后2～4 w，與對照組比較，丙泊酚組、UC-MSCs組及聯(lián)合組的評分均更高，其中聯(lián)合組分數(shù)最高(P<0.05)，見表1。

2.3HE染色和熒光顯微鏡觀察 通過對HE染色后的大鼠脊髓組織切片進行觀察，對照組可見明顯的脊髓損傷空洞，而其他組脊髓空洞明顯減小，其中聯(lián)合組空洞面積最小，見圖2。通過熒光顯微鏡觀察注射經(jīng)CM-Dil標記后的UC-MSCs組脊髓切片，可見散在紅色熒光，且聯(lián)合組被熒光標記細胞數(shù)更多，見圖3。

圖1 第3代UC-MSCs形態(tài)學觀察(×200)

表1 各時間點BBB評分、斜板試驗、改良Tarlov評分

與同時點對照組比較：1)P<0.05

對照組

丙泊酚組

UC-MSCs組

聯(lián)合組

對照組

丙泊酚組

UC-MSCs組

聯(lián)合組

2.4SEP和MEP的檢測結果 脊髓損傷模型建立后，治療各組大鼠SEP、MEP均未被檢測到，傷后4 w，MEP、SEP均有不同程度恢復(P<0.05,P<0.01)，對照組輕微恢復電位，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2，表3。

表2 傷后4 w各組SEP檢測

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

2.5HRP逆行神經(jīng)示蹤 HRP注射后經(jīng)逆行運輸，觀察4組脊髓損傷模型大鼠的脊髓切片可見T8以上節(jié)段有被HRP標記的神經(jīng)纖維。見圖4。對照組可見少量的神經(jīng)纖維(14.24±3.51)個/高倍視野，另外經(jīng)過治療的三組神經(jīng)纖維數(shù)目都較之明顯升高，盡管丙泊酚組及UC-MSCs組〔(21.52±4.40，20.38±3.84)個/高倍視野〕比對照組明顯增高，但對比聯(lián)合組明顯減低〔(31.21±5.40)個/高倍視野，P<0.01〕。

表3 傷后4 w各組MEP檢測

對照組

UC-MSCs組

聯(lián)合組

丙泊酚組

3 討 論

脊髓損傷的發(fā)病率上升趨勢越發(fā)明顯，其原因與社會工業(yè)化程度的日益加深及經(jīng)濟高速發(fā)展有著密切的聯(lián)系〔18，19〕。脊髓一旦發(fā)生損害，患者的生活質量及疾病預后都十分不樂觀，因其損傷后的脊髓不能自我修復、再生，從而隨著損傷后繼發(fā)的一系列神經(jīng)系統(tǒng)病理變化，可能會對病人造成永久性的神經(jīng)損傷，導致極高的致殘率及死亡率。急性脊髓損傷所導致的一過性損傷，大量的自由基在損傷區(qū)域產(chǎn)生，介導之后的一系列氧化反應，同時自由基、細胞因子等觸發(fā)細胞凋亡，引起很多繼發(fā)性的病理變化，導致?lián)p傷區(qū)域的神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失〔16，20～23〕。

臨床上現(xiàn)有的針對脊髓損傷的治療方法，多是通過對營養(yǎng)神經(jīng)藥物的應用，從而維持脊髓神經(jīng)系統(tǒng)的現(xiàn)有功能，同時配合一定的肢體康健治療，促進瀕臨壞死的神經(jīng)元的功能恢復〔24，25〕。但是，脊髓神經(jīng)細胞本身已經(jīng)不具有自我修復及再生的功能，現(xiàn)有的常用治療手段只能使肢體功能部分恢復，不能達到損傷前水平，甚至導致肢體致殘后，不僅影響患者生活質量，更對患者心理有不良作用。如何使脊髓神經(jīng)細胞在體外誘導分化成為遺傳穩(wěn)定的組織細胞干細胞是研究者關注中心〔26，27〕。UC-MSCs是一類存在于新生兒臍帶組織中的干細胞，是其他細胞的“種子”，具有強大的分化能力，并且也有一定的遷移能力，可以成為骨髓神經(jīng)元的良好供體。UC-MSCs移植進脊髓損傷的機體后，通過釋放趨化因子遷移進入損傷區(qū)域，分化成為所需要補充的細胞，同時降低炎性反應，從而使得脊髓組織重構，恢復神經(jīng)系統(tǒng)功能〔28，29〕。

本文結果顯示，丙泊酚對損傷的脊髓神經(jīng)組織具有保護作用，丙泊酚聯(lián)合UC-MSCs移植治療脊髓大鼠損傷，使得神經(jīng)元再生，對下肢的神經(jīng)生理功能有著極大的改善，運動功能恢復良好，有助于日后臨床工作中成為治療方法的另一種選擇。

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