杜 鋒

(甘肅省第二人民醫(yī)院急診科，甘肅 蘭州 730000)

脂多糖是引發(fā)炎癥和休克的主要介質(zhì)之一，可誘導心肌細胞炎性因子表達，引發(fā)心肌細胞肥大、凋亡，導致充血性心力衰竭〔1〕。心肌損傷是導致難治性低血壓及膿毒癥死亡的主要因素，通過體外缺氧處理可較好地模擬體內(nèi)心肌缺血狀態(tài)〔2〕。微小RNA(miRNA)在細胞多種代謝途徑中起到關鍵調(diào)控作用。相關研究顯示，miRNA參與了脂多糖的病理生理過程，脂多糖可通過影響miRNA表達進而調(diào)節(jié)細胞凋亡和炎癥反應〔3〕。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-211在卵巢癌等多種腫瘤細胞中異常表達，而Sirt1可能是miR-211潛在的作用靶蛋白〔4〕。本研究旨在探究miR-211/ Sirt1信號通路在脂多糖對心肌細胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肥大心肌組織取自甘肅省第二人民醫(yī)院行風心病換瓣手術的患者二尖瓣乳頭肌；脂多糖購于北京中生瑞泰科技有限公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒、細胞增殖與活性檢測(CCK-8)試劑盒、蛋白裂解液購于上海玉博生物科技有限公司；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Sybr GreenⅡ購于北京亞太恒信生物科技有限公司；Sirt1抗體購于美國CST中國分公司。

1.2方法

1.2.1心肌細胞分離與純化 取二尖瓣乳頭肌組織，剪成邊長為1 mm3的正方體組織糜，3 g/L胰蛋白酶和1 g/L膠原酶消化后收集懸液，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，3 000 r/min離心10 min，棄上清，培養(yǎng)基懸浮，接種在3 cm細胞培養(yǎng)皿中，差速貼壁法在細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，將培養(yǎng)液離心后再次接種到培養(yǎng)基中，細胞密度約為6×105/L，每3 d換液1次，取4～6 d細胞進行實驗。細胞經(jīng)電鏡、免疫組化鑒定，除肥大外無其他病變。加入不同濃度脂多糖進行處理6 h后將其分為對照組、40 μg/ml脂多糖組及60 μg/ml脂多糖組。

1.2.2缺氧條件下培養(yǎng)心肌細胞 先用大培養(yǎng)皿將DMEM培養(yǎng)基展開放入低氧(3%O2、5%CO2、95%N2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，取4～6 d狀態(tài)良好的原代心肌細胞，棄去原培養(yǎng)液，滴加胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，光學顯微鏡下觀察，多數(shù)細胞變圓、突起收回時用吸管去除酶溶液，加入3～4 ml經(jīng)低氧飽和處理的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃的3%O2、5%CO2、95%N2培養(yǎng)箱，在此缺氧條件下培養(yǎng)24 h，再放回22%O2、5%CO2的培養(yǎng)箱中4 h。

1.2.3原位末端標記(TUNEL)測定凋亡細胞 采用TUNEL法標記凋亡細胞，取3組細胞，用10%中性甲醛溶液固定20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用0.3% TRITONX-100通透10 min，PBS洗滌后按1∶9比例混合A液和B液，將配成的TUNEL反應混合液均勻覆蓋到細胞表面，常規(guī)培養(yǎng)2 h，PBS洗滌后用含DAPI的HOCHEST封片，熒光顯微鏡下定量分析。

1.2.4qRT-PCR檢測miR-211表達水平 分別于脂多糖處理前后、缺氧誘導后使用RNAiso試劑提取3組細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR擴增引物由北京亞太恒信生物科技有限公司合成。反應體系10 μl，cDNA 1 μl、上下游引物各1 μl、dNTP 1 μl、蒸餾水6 μl，進行標準PCR擴增步驟。對混合反應物進行變性處理，共40個循環(huán)(95℃ 40 s變性，60℃ 30 s退火，72℃ 40 s延伸)，之后在72℃ 5 min最終擴增。以U6為內(nèi)參，計算miR-211相對表達量。

1.2.5Western印跡檢測 蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量。分別取30 μg總蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉后滴加Sirt1抗體(1∶1 000)，β-actin單抗為內(nèi)參，4℃培養(yǎng)過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，繼續(xù)培養(yǎng)4 h電化學發(fā)光(ECL)顯色后置于暗室中顯影、定影，分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1脂多糖對缺氧誘導心肌細胞凋亡的作用 脂多糖組心肌細胞凋亡率明顯高于對照組(3.40%±0.81%，P<0.05)；60 μg/ml脂多糖組(9.38%±1.40%)明顯高于40 μg/ml脂多糖組(7.16%±1.17%，P<0.05)。見圖1。

圖1 脂多糖對缺氧誘導的心肌細胞凋亡的影響(×200)

2.2脂多糖對心肌細胞中miR-211表達的影響 脂多糖處理前，3組細胞中miR-211相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；脂多糖處理6 h和缺氧誘導后，40、60 μg/ml脂多糖組細胞中miR-211相對表達量均明顯高于同期對照組和脂多糖處理前(P<0.05)，其中60 μg/ml脂多糖組上升更明顯。見表1。

表1 脂多糖誘導對3組心肌細胞中miR-211表達的影響

與同期對照組比較：1)P<0.05；與脂多糖處理前比較：2)P<0.05

2.3miR-211上調(diào)對靶蛋白Sirt1表達的影響 脂多糖處理前，對照組、40、60 μg/ml脂多糖組Sirt1蛋白相對表達量(1.88±0.35、1.91±0.47、1.76±0.68)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；脂多糖處理6 h后和缺氧誘導后，40 μg/ml脂多糖組(0.75±0.20，0.44±0.28)、60 μg/ml脂多糖組(0.62±0.24，0.37±0.14)均明顯低于同期對照組(1.86±0.41，1.79±0.36；P<0.05)，其中60 μg/ml脂多糖組Sirt1表達量下降更明顯。見圖2。

圖2 脂多糖對3組心肌細胞中Sirt1表達的影響

3 討 論

miRNA是一類具有調(diào)控功能的非蛋白編碼RNA，在維持細胞生長、凋亡方面具有重要意義；其在免疫系統(tǒng)和部分炎癥反應中也具有重要調(diào)控作用〔5〕。相關研究發(fā)現(xiàn)，上皮細胞可在脂多糖作用下下調(diào)miR-16表達，上調(diào)促凋亡因子FoxA1表達，發(fā)揮誘導細胞凋亡的作用〔6〕。動物實驗顯示，通過盲腸結(jié)扎穿孔建立小鼠膿毒癥模型，miR-216表達水平增加，心肌細胞凋亡率降低，保護心肌正常功能，緩解心肌損傷〔7〕。

miR-211在多種腫瘤細胞中表達異常，在腫瘤細胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。相關研究顯示，結(jié)合miR-211靶向治療可明顯增加神經(jīng)瘤膠質(zhì)細胞凋亡率和DNA損傷情況〔8〕。部分miRNAs還可調(diào)控靶蛋白Sirt1的表達，人結(jié)腸癌細胞中miR-42a可通過Sirt1調(diào)節(jié)細胞凋亡；miR-184可通過調(diào)節(jié)Sirt1表達在心肌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用〔9，10〕。上述研究均提示miRNAs可通過調(diào)控Sirt1表達來影響心肌細胞凋亡。本研究結(jié)果提示，脂多糖促進缺氧誘導心肌細胞凋亡具有特殊性。進一步對誘導心肌細胞凋亡的機制進行分析，提示脂多糖促進缺氧誘導的心肌細胞凋亡可通過上調(diào)miR-211水平來抑制Sirt1的表達參與缺氧誘導的心肌細胞凋亡過程。

1薛大忠,趙自剛,牛春雨,等.線粒體損傷及其在心肌細胞損傷中的作用〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(1):223-7.

2康 波.miRNA-1在硫化氫抑制心肌細胞凋亡過程中的功能及機制〔D〕.上海：第二軍醫(yī)大學,2011.

3李 熠.TGR5在高糖誘導小鼠心肌細胞凋亡中的作用及其機制〔D〕.瀘州：四川醫(yī)科大學,2015.

4林 林,蔣婷婷.大豆異黃酮對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌纖維化的保護作用〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2014;15(6):739-42.

5姚新亮,閆成蕓,張 韓,等.他汀類藥物對心肌缺血再灌注心肌細胞 Bax 和 Bcl-2表達的調(diào)控〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(19):4726-8.

6許曉玲.CYP11A1、CYP 2E1在IGF-1通過線粒體機制保護心肌細胞免于凋亡中的作用〔D〕.湛江：廣東醫(yī)學院,2013.

7吳柱國.胰島素樣生長因子1保護心肌細胞免于凋亡機制的探討〔D〕.廣州：廣州醫(yī)學院,2010.

8王海珠.氯吡格雷抵抗對伴糖尿病的冠心病患者冠脈介入預后影響及相關因素〔J〕.中國衛(wèi)生工程學,2017;16(2):234-5.

9吳婷婷.X盒結(jié)合蛋白1在糖尿病心肌病心肌細胞凋亡中的作用機制研究〔D〕.濟南：山東大學,2012.

10梅文靜.胰島素生長因子1對大鼠心肌細胞BTEB、SP1基因表達調(diào)控及相關抗凋亡機制的研究〔D〕.湛江：廣東醫(yī)學院,2011.