羅維蕓 王麗娟 何揚芳 許世清 蔡寒青

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長春 130041)

糖尿病腎病是常見的糖尿病微血管病變之一，早期表現(xiàn)為尿白蛋白排泄增加，最終可導(dǎo)致患者出現(xiàn)慢性腎功能不全。糖尿病腎病的發(fā)生機制十分復(fù)雜，胰島素降糖治療不能真正阻斷其病變進展。C肽是與胰島素等分子量合成與分泌的多肽類物質(zhì)，既往認為其無明顯生物學(xué)活性〔1〕。然而，早期臨床觀察顯示，同時給予C肽和胰島素治療1型糖尿病患者，可降低腎小球高濾過，從而改善腎小球功能及代謝控制，而單獨應(yīng)用胰島素治療則無此作用〔2〕。在胰島移植治療的1型糖尿病患者中，也觀察到尿蛋白排泄減少和腎功能改善〔3〕，推測與C肽有關(guān)。本文擬分析C肽治療對糖尿病腎病GK大鼠模型氧化應(yīng)激的影響。

1 材料及方法

1.1材料 8周齡SPF級GK大鼠〔上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(滬)2007-0005〕及同齡雄性Wistar大鼠〔北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(京)2006-0009〕。主要試劑：高脂飼料(中國科學(xué)院實驗動物中心)；微量滲透壓泵(Alzet公司，美國)；大鼠C肽(Sigma公司，美國)；大鼠白蛋白酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(Assaypro公司，美國)；二喹啉甲酸(BCA)法蛋白測定試劑盒(碧云天公司)；RNeasy總RNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)；SYBR green PCR試劑盒(Toyobo公司，日本)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(Millipore公司，美國)。

1.2方法

1.2.1糖尿病腎病大鼠動物模型的制備 采用高脂飼料喂養(yǎng)GK大鼠并監(jiān)測血糖，當連續(xù)3 d血糖≥16.7 mmol/L時判斷為糖尿病模型建立成功。成模后的糖尿病GK大鼠繼續(xù)給予正常飼料喂養(yǎng)持續(xù)10 w，直至測定尿蛋白≥300 mg/24 h時，判斷為糖尿病腎病模型。

1.2.2實驗動物分組 將15只糖尿病腎病GK大鼠隨機分為3組(n=5)。C肽治療組：在大鼠腹腔手術(shù)植入含2 ml C肽溶液的微量滲透壓泵，設(shè)置50 pmol·kg-1·min-1的恒速緩慢腹腔釋放，每28 d后更換1次；對照組：同樣步驟植入含等量生理鹽水的微量滲透壓泵；胰島素治療組：予甘精胰島素2.5 IU，皮下注射1次/d。正常組(n=5)為同齡正常飼養(yǎng)Wistar大鼠；各組均治療16 w。

1.2.3功能評價

1.2.3.1血糖、24 h尿蛋白及24 h尿白蛋白定量 治療前及治療后1次/4 w分別測定大鼠尾靜脈空腹血糖；治療前及治療后每4 w將大鼠置于代謝籠收集24 h尿，分別用ELISA法測定24 h尿蛋白(BCA法蛋白測定試劑盒)及24 h尿白蛋白(大鼠白蛋白ELISA檢測試劑盒)。

1.2.3.2腎臟病理改變 治療結(jié)束后處死動物，生理鹽水灌洗后獲取腎臟，其中部分腎組織置于10%中性甲醛固定，石蠟包埋并制備病理切片；部分腎組織以2.5%戊二醛固定，制作透射電鏡標本；其余腎組織取腎皮質(zhì)部分物理研磨，收集經(jīng)100目金屬篩網(wǎng)濾過的細胞懸液，4℃低溫離心，再經(jīng)M199溶液重懸沉淀后過300目金屬篩網(wǎng)，收集獲得腎小球。

1.2.3.3免疫組化 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水、熱修復(fù)后，先以3%H2O2封閉，再分別與一抗羊抗人超氧化物歧化酶(SOD)-1抗體(1∶800)、兔抗小鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體(1∶800)，4℃孵育過夜。次日分別加入二抗辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG或羊抗兔IgG抗體，于37℃條件下孵育反應(yīng)30 min。最后再以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染后封片鏡檢。

1.2.3.4實時定量(RT)-PCR 應(yīng)用RNeasy總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別進行各組腎小球總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBR green PCR試劑盒，應(yīng)用ABI PRISM 7300序列檢測系統(tǒng)經(jīng)兩步法進行目的基因的PCR擴增，PCR引物序列詳。SOD ：上游：5′-GGTTCACCGCTTGCCTTCT-3′，下游：5′-TTGCACCTTCGTTTCCTG-3′，長度176 bp；iNOS：上游：5′-CACCTTGGAGTTCACCCAGT-3′，下游：5′-ACCACTCGTACTTGGGATGC-3′，長度170 bp；β-actin：上游：5′-GACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′，下游：5′-ATAGAGCCACCAATCCACACAGAG-3′，長度173 bp。以2-ΔΔCt法半定量分析各組腎小球組織SOD基因及iNOS基因在mRNA水平表達的差異。

1.2.3.5Wester印跡 提取各組糖尿病腎病大鼠腎小球總蛋白，分別取各組30 μg總蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后封閉、洗膜，分別加入羊抗人SOD-1抗體(1∶200)、兔抗小鼠iNOS抗體(1∶800)及小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(0.5 μg/ml)，4℃下雜交反應(yīng)過夜。次日洗膜后用辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG(1∶15 000)、羊抗兔lgG(1∶15 000)或羊抗小鼠IgG(0.25 μg/ml)分別進行二抗雜交。最后使用ECL試劑顯色，暗室曝光成像。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血糖、24 h尿蛋白定量及24 h尿白蛋白定量比較 治療后胰島素治療組血糖顯著下降(P<0.05)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，C肽治療組血糖無顯著下降，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C肽治療組24 h尿蛋白及24 h尿白蛋白均顯著減少(P<0.01)，胰島素治療組無明顯降低，C肽治療組明顯優(yōu)于胰島素治療組(P<0.01)。見圖1。

2.2各組腎小球PAS染色及投射電子顯微鏡下腎小球形態(tài)學(xué)改變 光鏡下腎臟PAS染色顯示：正常組大鼠腎小球毛細血管袢薄而清晰；對照組腎小球系膜細胞增生，基底膜明顯增厚，毛細血管袢有大量不規(guī)則、結(jié)節(jié)狀PAS陽性物質(zhì)沉積，腎小球球囊間隙明顯變窄，部分幾乎消失；C肽治療組腎小球毛細血管袢則較規(guī)則、清晰，PAS陽性物質(zhì)沉積較少，腎小球囊間隙存在；胰島素治療組的腎小球硬化與對照組相近。電鏡下，與正常大鼠腎臟相比，對照組大鼠基底膜明顯增厚，系膜區(qū)基質(zhì)增多，足細胞排列不規(guī)則，部分足突缺失或融合；C肽治療組基底膜增厚改變較輕，足細胞的形態(tài)和排列紊亂也較輕，均明顯優(yōu)于胰島素治療組。見圖2。

圖1 各組血糖、24 h尿蛋白及24 h尿白蛋白比較

圖2 各治療組腎小球基底膜的病理改變

圖3 各組腎小球SOD與iNOS表達的差異(×400)

2.3免疫組化染色結(jié)果 如圖3針對SOD的免疫組化染色顯示，正常組大鼠腎臟染色濃集，腎小球系膜細胞可見棕黃色陽性染色；對照組大鼠腎小球陽性染色明顯減少，而C肽治療組腎小球系膜細胞的陽性染色較胰島素治療組及對照組明顯增多。針對iNOS的免疫組化染色顯示，相對于正常組大鼠腎小球，對照組腎小球與活性氧(ROS)產(chǎn)生過多相關(guān)的iNOS表達上調(diào)，C肽治療顯著下調(diào)糖尿病腎病大鼠腎小球iNOS的表達；胰島素治療也可以部分降低iNOS在腎小球的表達。

2.4RT-PCR和Wester印跡方法檢測腎小球SOD及iNOS mRNA、蛋白表達 RT-PCR結(jié)果顯示，正常組設(shè)為1，對照組腎小球iNOS mRNA表達上調(diào)5.09倍，SOD表達降低65%(P<0.05)；C肽治療組顯著下調(diào)iNOS mRNA表達至正常大鼠的1.57倍，升高SOD

mRNA表達至正常大鼠的82%(P<0.05)；胰島素治療組也可以部分降低iNOS mRNA在腎小球的表達至正常大鼠的3.5倍(P<0.05)，但對SOD mRNA在腎小球的表達(0.76)無明顯影響(P>0.05)。Western 印跡檢測各組蛋白水平見圖4。

1～4：正常組，對照組，C肽治療組，胰島素治療組圖4 各組SOD及iNOS在mRNA與蛋白水平的表達差異

3 討 論

近年來研究顯示，C肽可能具有防治糖尿病微血管病變的作用和應(yīng)用價值〔3〕，其中在防治糖尿病腎病方面，有動物實驗發(fā)現(xiàn)C肽治療1型糖尿病大鼠可降低腎小球高濾過和尿蛋白漏出〔4〕。C肽治療還能抑制糖尿病大鼠的Ⅳ型膠原合成，從而減緩細胞外基質(zhì)增生并抑制腎小球增生〔5〕。在體外培養(yǎng)的腎臟微血管內(nèi)皮細胞，C肽可阻斷高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生〔6〕。本研究提示C肽治療降低尿蛋白排泄的作用獨立于降糖作用之外。

氧化應(yīng)激被認為是糖尿病腎病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，也是糖尿病腎損傷的誘發(fā)因素。氧化應(yīng)激是由ROS和高血糖的氮元素產(chǎn)生，可以引起基因表達的異常、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變及誘導(dǎo)糖尿病腎病發(fā)展途徑的激活〔7〕。研究顯示多種分子途徑參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展〔8〕。這些途徑包括蛋白激(PK)C、多元醇和己糖胺通路的激活及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β的增加，其他途徑還包括MAPK通路的活化，晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的增加，內(nèi)皮素受體的激活及信號通路和表觀遺傳學(xué)機制。此外，大量的研究數(shù)據(jù)表明抗氧化劑對于糖尿病并發(fā)癥(包括糖尿病腎病)的進展有潛在的預(yù)防作用，如維生素E、α-硫辛酸、N-乙酰半胱氨酸等〔9～12〕。本研究結(jié)果提示C肽治療可能通過抑制氧化應(yīng)激而減緩糖尿病腎病病變進展，改善腎小球基底膜增厚等結(jié)構(gòu)異常，并減少尿蛋白排泄，達到防治糖尿病腎病的作用。

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