秦 毅，呂國英，張作法，*

(1.浙江大學(xué) 技術(shù)轉(zhuǎn)移中心，浙江 杭州 310058；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021)

人乳鐵蛋白(human lactoferrin， hLF)是一種分子量約為80 ku的多肽蛋白，主要存在于乳汁、眼淚、唾液等外分泌液或血漿、中性粒細胞中。hLF在人初乳中含量較高，達到6～8 mg·mL-1[1]。hLF具有廣泛的生物學(xué)活性，如防止新生兒敗血癥，促進哺乳動物細胞生長，防輻射，抗菌，抗病毒，宿主防御和免疫調(diào)節(jié)功能，抗腫瘤等[2-6]，被認為是一種新型的抗菌、抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品和飼料添加劑。

乳鐵蛋白的多種生物學(xué)功能使其具有廣闊的應(yīng)用前景，以前乳鐵蛋白主要從動物乳中提取，但由于天然乳鐵蛋白在乳汁中含量低，高昂的成本限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。hLF更是由于缺乏原料，不能大量生產(chǎn)。在這種情況下，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)為生產(chǎn)乳鐵蛋白提供了新的技術(shù)手段。近年來，hLF基因被成功地轉(zhuǎn)入馬鈴薯、番茄、煙草和水稻等植物中，以提高作物的營養(yǎng)保健品質(zhì)[7-10]。Anzai等[11]把人乳鐵蛋白基因置于水稻谷蛋白啟動子的控制下，再轉(zhuǎn)入水稻中，成功獲得了特異性表達的轉(zhuǎn)基因水稻植株。最近我國浙江大學(xué)的Lin等[12]也將人乳鐵蛋白基因成功轉(zhuǎn)入主栽水稻秀水110號，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻中的hLF含量達到24.7 mg·kg-1，是其父本鐵含量的2倍。胡貽椿[13]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因水稻對健康沒有副作用，而且營養(yǎng)學(xué)質(zhì)量優(yōu)于父代品種。相比其他植物，hLF在水稻中表達量最高(是其他植物的25～40倍)[14]，所以從轉(zhuǎn)基因水稻中提取hLF是獲取此種蛋白較為經(jīng)濟有效的一種方式。與其他作物相比，水稻有以下3個優(yōu)勢: (1)稻米可以貯藏多年而營養(yǎng)物質(zhì)不會損失，因此乳鐵蛋白的獲得不依賴于生長季節(jié)[15]；(2)稻米致敏性低，因此利用水稻生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白是可靠的[16，17]；(3)水稻是自花授粉的作物，交叉授粉的幾率很低[18]。

本研究在獲得轉(zhuǎn)基因水稻的基礎(chǔ)上，按照飽和硫酸銨鹽沉淀、弱陽離子交換層析、分子篩層析等方法提取和純化rhLF，并對純化后蛋白進行清除自由基和免疫活性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

rhLF由浙江大學(xué)轉(zhuǎn)基因研究中心提供，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將hLF基因?qū)刖拘闼?10號獲得，乳鐵蛋白的含量占種子干質(zhì)量的0.5%，其提取過程按吳景歡等[19]報道的方法進行。

RAW264.7巨噬細胞株購于中科院上海生命科學(xué)研究院；DMEM(高糖)培養(yǎng)基購于Gibco公司、胎牛血清購于上海四季青公司；DPPH (1，1-二苯基-2-苦基肼)、 ABTS[2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)]、PBS，青霉素、鏈霉素、脂多糖、0.25%胰蛋白酶-EDTA和Griess試劑盒購于Sigma 公司。其余試劑均為分析純試劑。

1.2 蛋白檢測方法

分離純化后的rhLF濃度的測定采用SDS-PAGE法。用10%的分離膠和5%的積層膠，對收集到的蛋白樣品進行電泳，考馬斯亮藍染色法顯色蛋白條帶。

1.3 rhLF清除自由基實驗

1.3.1 清除DPPH自由基

不同濃度的各樣品1.0 mL，加入到3 mL DPPH(5 mmol·L-1)中，搖勻，25 ℃放置30 min，然后在515 nm下測定其吸光度，以抗壞血酸為對照，DPPH清除活性可用以下公式來計算樣品的清除率：

清除率(%)=[(D空白-D樣品)/D空白]×100。

式中：D樣品為樣品溶液的吸光值；D空白為空白溶液的吸光值。

1.3.2 清除ABTS+自由基

ABTS+混合液的制備：將7 mmol·L-1ABTS水溶液與2.45 mmol·L-1過硫酸鉀水溶液混合，將混合液在室溫條件下避光放置12～16 h，形成ABTS+自由基儲備液。將此工作液用磷酸緩沖液稀釋，在734 nm下調(diào)其吸光度為0.700±0.02，得到ABTS+混合液，于30 ℃下預(yù)熱備用。取0.5 mL溶液加入1 mL ABTS+混合液混合均勻，室溫下避光靜置30 min后于波長734 nm下測定吸光值，以去離子水作為空白對照。

ABTS+清除率(%)=(1-D樣品/0.7)×100。

式中D樣品為樣品溶液的吸光值。

1.3.3 清除羥基自由基活性

1mL 樣品液中加入6 mmol·L-1FeSO4溶液1 mL，混勻后加入6 mmol·L-1H2O2溶液1 mL，混勻后靜置10 min， 加入6 mmol·L-1水楊酸1 mL，混勻后37 ℃水浴反應(yīng)30 min， 3 000 r·min-1離心10 min， 取上清液于510 nm處測定吸光值，以蒸餾水作為空白對照組，計算清除率。

清除率(%)=[(D空白-D樣品)/D空白]×100。

式中：D樣品為樣品溶液的吸光值；D空白為空白溶液的吸光值。

1.4 rhLF對RAW264.7細胞的作用研究

1.4.1 小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞培養(yǎng)

采用DEME培養(yǎng)基(100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素、10% FBS)， 于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，細胞生長至90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，傳代，取對數(shù)生長細胞進行實驗。

1.4.2 RAW264.7細胞增殖的檢測

調(diào)整細胞密度為1×104mL-1，接種于96孔板，體積為100 μL， 于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，加入100 μL不同濃度的rhLF，使最終濃度為0.062 5，0.125 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0和2.000 0 mg·mL-1，設(shè)空白對照組。以100 μg·mL-15-FU為陽性對照，培養(yǎng)48 h后加入CCK-8，輕輕振蕩，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。酶標(biāo)儀于490 nm處檢測吸光值，每個平行濃度設(shè)3個重復(fù)。

1.4.3 RAW264.7細胞吞噬活性的檢測

調(diào)整細胞密度為3×105mL-1，接種于96孔板，體積為100 μL，于37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)24 h后，加入100 μL不同濃度的測試樣品，使最終濃度為0.25～3.00 mg·mL-1，設(shè)空白對照組。培養(yǎng)48 h后棄去上清，每孔加入100 μL 0.072%中性紅試劑，于37 ℃，5% CO2下培養(yǎng)箱孵育30 min， 棄去中性紅，用PBS清洗3次，每次100 μL，并甩干。每孔加入醋酸-乙醇(體積比1∶1)細胞裂解液100 μL，4 ℃過夜，用酶標(biāo)儀于570 nm檢測吸光值，每個平行濃度設(shè)3個重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 純化后的rhLF SDS-PAGE 純度檢測

從轉(zhuǎn)基因水稻中經(jīng)硫酸銨分級沉淀、弱陽離子交換層析、分子篩層析及膜包脫鹽濃縮后，獲得較高純度的rhLF(圖1)。

2.2 rhLF的抗氧化實驗

2.2.1 rhLF的DPPH清除活性

DPPH是一種非常穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有強吸收，當(dāng)遇到自由基清除劑時，其分子上的單電子被配對而使顏色變淺，可以用此來評價試樣的抗氧化能力[20]。

從圖2可知，隨著濃度的增加， rhLF對DPPH自由基的清除率逐漸升高，其濃度與清除度有良好的量效關(guān)系。在0.125～4.000 mg·mL-1濃度下，rhLF的DPPH清除率在18.32%～78.90%。與陽性對照抗壞血酸相比，rhLF的清除率偏低。抗壞血酸在測試濃度范圍內(nèi)一直顯示了很強的抗氧化活性，即使在最低濃度下(0.125 mg·mL-1)，DPPH清除率也達到了84.36%。

2.2.2 rhLF的清除ABTS自由基活性

由圖3可知，rhLF對ABTS清除率隨著濃度的增加逐漸增大，總體上變化不劇烈，濃度與清除率存在很好的線性關(guān)系。在濃度為4 mg·mL-1時，rhLF對ABTS 的清除率達到了86.5%。陽性對照組抗壞血酸顯示了很強的抗氧化活性。在所測試的濃度范圍內(nèi)，抗壞血酸的ABTS清除率都非常高，最低也接近于90%。

2.2.3 rhLF清除羥基自由活性

在所有的氧自由基中，羥基自由最強，危害也最大，所以對清除羥基自由基的研究非常重要。羥基自由基清除的原理是抗氧化劑通過與H2O2爭奪金屬離子進而抑制羥基自由基的產(chǎn)生。如圖4所示，rhLF對羥基自由基的清除率隨濃度的增加逐漸增大，總體上變化不劇烈。 抗壞血酸對羥基自由基的清除率隨濃度增大，先緩慢升高，當(dāng)達到某一閾值后急速升高，表現(xiàn)出很強的對羥基自由基的清除效果。相對于陽性對照抗壞血酸， rhLF的抗羥基自由基的活性很低，在測試濃度范圍內(nèi)，4 mg·mL-1的濃度下，羥基自由基的清除率也僅為41.1%。而抗壞血酸在最低濃度(0.125 mg·mL-1)時，清除率就已達到了69.4%。本實驗通過研究rhLF對DPPH、ABTS及羥基自由基的清除效果來檢驗其抗氧化能力。結(jié)果顯示，rhLF對DPPH、ABTS 和羥基自由基具有一定的清除能力，并呈現(xiàn)劑量依賴型。

M， 蛋白質(zhì)Marker； 泳道1， 水稻常規(guī)種子陰性對照； 泳道2， 重組人乳鐵蛋白純化前； 泳道3， 蛋白純化后。M， Marker of protein; Lane 1， negative control; Lane 2， recombinant human lactoferrin before purification; Lane 3， recombinant human lactoferrin after purification.圖1 水稻轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 The SDS-PAGE analysis for the recombinant human lactoferrin from transgenic rice

圖2 水稻轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白清除DPPH活性Fig.2 Scavenging effects of recombinant human lactoferrin on DPPH

圖3 水稻轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白清除ABTS活性Fig.3 Scavenging effects of recombinant human lactoferrin on ABTS

2.3 rhLF的免疫調(diào)節(jié)作用

2.3.1 rhLF對RAW264.7細胞增殖的影響

由圖5 可知，隨著rhLF濃度的增加，RAW264.7細胞增殖率有所增高，當(dāng)濃度達到0.5mg·mL-1時，增加極顯著。當(dāng)濃度達到1 mg·mL-1時，rhLF促進細胞增殖率最高(62.41%)。隨著濃度的增加，對細胞的增殖有所下降。這說明，當(dāng)rhLF在低濃度時，顯著地促進RAW264.7細胞的增殖，但是當(dāng)濃度增加到一定值時，會對細胞的生長產(chǎn)生抑制作用。綜上所述，rhLF在0.062 5～1.000 0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)對RAW264.7細胞具有良好的增殖作用，能提高巨噬細胞的密度和活力，對于提高機體免疫力具有很大的作用。

圖4 水稻轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白的清除羥基自由基活性Fig.4 Scavenging effects of recombinant human lactoferrin on hydroxyl radical

2.3.2 rhLF對RAW264.7吞噬活性的影響

由圖6可知，當(dāng)濃度小于1 mg·mL-1，RAW264.7 吞噬活性呈較快的升高，隨著濃度的升高，吞噬活性變化不大。整體上劑量關(guān)系依賴不強烈。在濃度為2 mg·mL-1時，吞噬活性最高達到了69.89%。綜上所述，rhLF在測試濃度范圍內(nèi)對RAW264.7細胞吞噬活性有明顯的提高作用，它能增強RAW264.7 細胞對抗原的吞噬，進而加快巨噬細胞將抗原遞呈給其他免疫細胞，加速引發(fā)免疫反應(yīng)。本實驗研究了rhLF對RAW264.7細胞增殖及吞噬能力的影響，發(fā)現(xiàn)其能夠促進細胞增殖分裂，刺激免疫細胞增殖分裂，在對應(yīng)外來抗原和自身癌變中具有重要的意義。rhLF提高了RAW264.7的吞噬活性，進而提高了其捕捉抗原的能力，這對于提高機體免疫應(yīng)答有重要意義。rhLF對免疫細胞因子分泌的促進，對于免疫力的提高和癌癥抵抗方面不可或缺[21]。

圖5 水稻轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.5 Effects of recombinant human lactoferrin on cell proliferation in RAW264.7 cells by MTT assay

圖6 水稻轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白對RAW264.7細胞吞噬活性的影響Fig.6 Effects of recombinant human lactoferrin on phagocytic activity of RAW 264.7 cells

前期對乳鐵蛋白的抗氧化和免疫活性已有研究，李婷等[22]利用牛乳中提取的乳鐵蛋白來研究其抗氧化活性，認為乳鐵蛋白能夠結(jié)合鐵離子來實現(xiàn)抗氧化活性；戴亞妮等[23]則研究了轉(zhuǎn)基因牛乳中的乳鐵蛋白的抗氧化活性，認為其可以作為天然抗氧化劑添加到保健品或化妝品中。安清聰?shù)萚24]研究發(fā)現(xiàn)，牛乳中分離的乳鐵蛋白能提高斷奶仔豬的血清抗氧化指標(biāo)及組織中抗氧化基因的表達。在提高免疫力方面，胡志和等[25]研究發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白能夠顯著提高小鼠的免疫力。但是，以上研究主要集中在牛乳中分離到的乳鐵蛋白或轉(zhuǎn)乳鐵蛋白，而對水稻中的轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白的清除自由基和免疫活性卻沒有任何報道。

動物實驗表明，乳鐵蛋白安全可靠，無副作用，能夠促進新生兒鐵吸收，具有抗菌、調(diào)節(jié)機體免疫力的作用，因此可以作為新生兒奶粉的營養(yǎng)配方[26]，保護新生兒健康，促進其生長發(fā)育。乳鐵蛋白可以作為新型的功能型配料用于保健食品，提高免疫力，改善影響性貧血，延緩衰老，還可以作為食品抗氧化劑及食品防腐劑。轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白可以作為動物飼料添加劑，從而減少抗生素的應(yīng)用[27]，乳鐵蛋白中有各種黏膜病菌的受體被發(fā)現(xiàn)預(yù)示了其在開發(fā)為藥物治療的應(yīng)用[28]。總之，轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白對DPPH、ABTS和羥基自由基具有一定的清除能力，并能促進免疫細胞的增殖和增強免疫細胞的吞噬活性。本實驗研究結(jié)果對于開發(fā)以轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白為原料的保健食品有重要指導(dǎo)意義。

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