黃勝佳，葉 霜，劉新亞，席利娟，汪志輝，b，*，付佳玲

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) a. 園藝學(xué)院；b. 果蔬研究所，四川 成都 611130)

中國是柑橘果樹的重要起源地之一，具有豐富的柑橘種質(zhì)資源。黃果柑是橘和橙的天然雜交柑[1]，具有特晚熟、極豐產(chǎn)、花果同樹等優(yōu)良性狀[2]。柑橘果實富含能參與人體新陳代謝、調(diào)節(jié)有關(guān)生理活動、對人體保健和疾病防治有重要作用的生物活性物質(zhì)——酚類物質(zhì)[3-5]。研究表明，酚類物質(zhì)具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抗過敏、抗癌、抗突變、抑菌等重要作用[8]。因此，研究不同肥料對柑橘酚類物質(zhì)含量的影響，對提高柑橘綜合利用價值具有積極意義。

國內(nèi)外在測定不同柑橘品種、不同部位，以及不同生長時期果實中酚類物質(zhì)含量等方面已有大量研究，但在環(huán)境因子，如土壤營養(yǎng)對柑橘生物活性物質(zhì)代謝的影響方面的研究還比較少。已有研究表明，適量限制氮、磷肥的施用有利于黃酮類物質(zhì)的積累[9]。氮素營養(yǎng)的缺乏會導(dǎo)致萜類、酚類等不含氮次生代謝產(chǎn)物的積累，而增加氮素營養(yǎng)會加速含氮次生代謝產(chǎn)物如生物堿、氰苷等的合成[10]。氮肥能顯著影響西紅柿幼苗中酚的含量[11]，也能影響枸杞中黃酮和類胡蘿卜素等生物活性物質(zhì)的含量。目前，關(guān)于肥料對植物酚類物質(zhì)含量影響的研究大多注重于氮肥用量，而有關(guān)有機肥等肥料對其影響的研究報道較少。

灰色關(guān)聯(lián)度分析法是一種針對灰色系統(tǒng)來決定因素主次及其關(guān)聯(lián)程度的評價方法。本研究結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析法評價不同施肥處理對黃果柑果實酚類物質(zhì)的影響，以期為增加果實保健價值和提高柑橘的綜合利用率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗基地與供試植株

試驗于四川省雅安市石棉縣小水村黃果柑示范園中進(jìn)行。選取生長健壯、樹勢樹形基本一致、株行距為3 m × 4 m、中等管理水平的9 a生黃果柑植株27株作為供試植株。

1.2 試驗材料

有機肥：發(fā)酵后的雞糞，N+P+K≥8%，有機質(zhì)含量≥40%。

無機肥：尿素(N≥46.3%)，四川玖源農(nóng)資化工有限公司生產(chǎn)；過磷酸鈣(P2O5≥12.0%)，四川廣漢市蜀峰化工有限責(zé)任公司生產(chǎn)；俄羅斯鉀肥(K2O≥60%)，江西宜春市騰達(dá)化工有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

有機無機復(fù)混肥：寶施靈黃果柑專用肥。具體配方為硫酸銨(10%)，尿素(19.6%)，磷酸一銨(15.9%)，硅鈣鉀肥(2.5%)，硝酸鉀(1%)，硫酸鉀(19%)，硫酸鋅(2%)，鉬酸銨(0.02%)，氨基酸(5%)，草炭(2%)，泥炭(2%)，堆肥(4%)，煙渣(2%)，青蒿(3%)，米皮(5%)，蘑菇渣(7%)。

標(biāo)準(zhǔn)品：柚皮素(naringenin)，柚皮苷(naringin)，新橙皮苷(neohesperidin)，咖啡酸(caffeic acid)，芥子酸(sinapic acid)，綠原酸(chlorogenic acid)，阿魏酸(ferulic acid)，沒食子酸(gallic acid)，對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)，均購自Sigma公司，純度均在98%以上；甲醇、甲酸和乙腈均為色譜純，購自麥克林公司；水為實驗室自制的超純水。

1.3 試驗設(shè)計

本試驗共選擇無機肥(A)、有機肥(B)、有機無機復(fù)混肥(C)3類肥料，每類肥料再分別設(shè)置低水平(1)、適量(2)、高水平(3)3種用量，共計9個處理，每處理重復(fù)3次，以1棵黃果柑作為1個重復(fù)。分別于幼果期(5月1日)、果實快速膨大期(8月5日)、轉(zhuǎn)色期(11月10日)各施肥1次。根據(jù)文獻(xiàn)[12]并結(jié)合當(dāng)?shù)攸S果柑園地土壤及施肥情況，設(shè)計肥料施用量(表1)，其中，A2、B2、C2均為每種類型肥料中最適黃果柑生長發(fā)育的肥料用量。施肥時，圍繞樹冠滴水線的施肥圈，施肥圈要求深度和寬度達(dá)到20～30 cm，以見根不傷根為宜，在施肥圈內(nèi)放入試驗設(shè)計用量的肥料，施有機肥時土肥混勻。

1.4 采樣

2016-04-15采收，分株單獨采摘，每株按樹冠外圍的東西南北4個方位隨機采取中等大小、成熟度相對一致、無病蟲害且無霉?fàn)€的果實共12個，采回后將果實皮肉分離，置于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 柑橘酚類物質(zhì)含量測定

1.5.1 樣品前處理

從-80 ℃冰箱中取果肉至研缽中，加入液氮研磨成粉末。準(zhǔn)確稱取0.5 g混合樣放入2 mL離心管中，避光條件下加入1.5 mL提取液(甲醇、水、甲酸體積比70%∶28%∶2%)，充分混勻。將離心管放入超聲裝置中輔助提取，超聲30 min后，5 000 r·min-1離心15 min。取出離心管，吸取上清液。用0.45 μm微孔濾膜過濾，貯存于-20 ℃，用于酚酸及類黃酮分析。

表1各處理的施肥安排

Table1Fertilization arrangement of treatments

kg

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用色譜純甲醇分別將每瓶定量的20 mg標(biāo)準(zhǔn)品溶解，定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成2 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。全程進(jìn)行避光處理。將上述母液用甲醇分別配制成0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100 mg·L-1的濃度梯度，再配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光保存于-20 ℃以下環(huán)境中。

對不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析，以標(biāo)樣的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出9種酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5.3 色譜條件

使用安捷倫1260液相色譜儀，C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動相A為10%甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫(洗脫程序如表2所示)；流速1 mL·min-1。

柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素在283 nm波長下檢測[13]；咖啡酸、芥子酸、綠原酸、阿魏酸在320 nm波長下檢測；沒食子酸、對羥基苯甲酸在260 nm波長下檢測[14]。

表2流動相配比與洗脫時間

Table2Flow matching ratio and elution time

t/minA/%B/%095525851542782250643655955

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析。綜合評價基于Critic和熵權(quán)2種客觀賦權(quán)法進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析

圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)品55 min內(nèi)分別在320、283、260 nm波長下的色譜圖。根據(jù)保留時間長短，峰依次為沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素。由圖1可知，8種酚類物質(zhì)出峰較好，說明本研究所用方法可滿足多種酚類物質(zhì)的同時分離。圖2為對羥基苯甲酸在260 nm波長下的色譜圖。由于對羥基苯甲酸出峰時間與綠原酸出峰時間相近，故分開測定。

根據(jù)色譜圖擬合的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3?？梢钥闯?，各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與峰面積呈良好的線性相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均超過0.999 1。

2.2 不同肥料對黃果柑酚酸類物質(zhì)含量的影響

由表4可知，不同施肥處理黃果柑酚酸含量組成差異較大。各處理條件下，在黃果柑果肉中均檢測到了綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、沒食子酸和對羥基苯甲酸。綠原酸含量以B2處理最高(4.765 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以A3處理最低(2.885 μg·g-1)?？Х人岷恳訠1處理最高(3.529 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以C1處理最低(2.692 μg·g-1)。阿魏酸含量以B1處理最高(1.101 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以C1處理最低(0.838 μg·g-1)。芥子酸含量以B2處理最高(1.749 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以C1處理最低(1.205 μg·g-1)。沒食子酸含量以B1處理最高(3.507 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以B3處理最低(1.595 μg·g-1)。對羥基苯甲酸含量以B2處理最高(6.261 μg·g-1)，顯著(P<0.05)高于其他處理，以C1處理最低(4.262 μg·g-1)?？傮w來看，酚酸類物質(zhì)含量最高的主要出現(xiàn)在B1、B2處理。這說明，低水平或適量的有機肥能顯著提高果肉中酚酸物質(zhì)含量。在施用無機肥的3個處理中，A1處理果肉中酚酸含量顯著(P<0.05)高于A2、A3處理，且僅次于B1、B2處理。這說明，施用低水平平氮磷的無機肥亦能取得較好效果。

1， 沒食子酸； 2， 綠原酸； 3， 咖啡酸； 4， 阿魏酸； 5， 芥子酸； 6， 柚皮苷； 7， 新橙皮苷； 8， 柚皮素。1， Gallic acid; 2， Chlorogenic acid; 3， Caffeic acid; 4， Ferulic acid; 5， Sinapic acid; 6， Naringin; 7， Neohesperidin; 8， Naringenin.圖1 混合標(biāo)樣在不同波長下的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard samples under different wavelength

1，對羥基苯甲酸 p-hydroxybenzoic acid.圖2 對羥基苯甲酸在260 nm波長下的色譜圖Fig.2 Chromatogram of p-hydroxybenzoic acid under 260 nm wavelength

表3標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

Table3Standard curve and correlation coefficient

樣品名稱回歸方程相關(guān)系數(shù)SampleRegressionequationCorrelationcoefficient咖啡酸Caffeicacidy=139.21x-86.5330.9996阿魏酸Ferulicacidy=107.09x-27.8130.9999綠原酸Chlorogenicacidy=35.869x-9.5490.9992芥子酸Sinapicacidy=100.16x-11.5231.0000新橙皮苷Neohesperidiny=41.455x-22.920.9993柚皮素Naringeniny=72.394x-53.7710.9991柚皮苷Naringiny=27.071x-0.7560.9999沒食子酸Gallicacidy=44.696x+21.6050.9997對羥基苯甲酸p-Hydroxybenzoicacidy=113.19x-16.5810.9996

表4黃果柑果肉中酚酸物質(zhì)含量

Table4Quantity of phenolic acid in Huangguogan sarcocarp

μg·g-1

表中所有含量均以鮮質(zhì)量計。同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Contents listed in the above table were calculated based on fresh weight. Data within the same column followed by no same letters indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

2.3 不同肥料對黃果柑中類黃酮物質(zhì)含量的影響

由表5可知，各處理果實中均檢測到了柚皮苷和新橙皮苷，但均未檢測到柚皮素。各處理柚皮苷含量在2.026～4.356 μg·g-1之間，新橙皮苷含量在0.546～0.757 μg·g-1之間。對比果肉中柚皮苷的含量可知，B3處理含量最高，且顯著(P<0.05)高于其他處理。同時，以B3、B2和A1處理的新橙皮苷含量較高。

2.4 基于Critic與熵權(quán)法的灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.4.1 熵權(quán)法分析

熵原本是熱力學(xué)的概念，主要用于形容指標(biāo)信息的離散程度。一般地，如果某個指標(biāo)的信息熵(Ej)越小，表明其指標(biāo)值的變異程度越大，提供的信息量越大，在綜合評價中所起的作用越大,其權(quán)重也應(yīng)越大；反之，某指標(biāo)的信息熵越大，表明其指標(biāo)值的變異程度越小，提供的信息量越小，在綜合評價中所起的作用越小，其權(quán)重也應(yīng)越小。

表5黃果柑果肉中類黃酮含量

Table5Quantity of flavonoid in Huangguogan sarcocarp

μg·g-1

ND, 未檢出。

ND, Not detected.

根據(jù)熵權(quán)法的計算步驟[15]，對不同酚類物質(zhì)的信息熵和權(quán)重熵(ωj)進(jìn)行測算(因柚皮素在所有處理下都未檢測到，故不予考慮)。由表6可知，柚皮苷、沒食子酸和綠原酸3個指標(biāo)的熵值低，差異性系數(shù)高，差異梯度較大，因此賦予高權(quán)重。柚皮苷權(quán)重值最大，為0.296 0；其次為沒食子酸(0.292 7)，綠原酸(0.128 4)，阿魏酸權(quán)重值最小，為0.034 5。所得指標(biāo)權(quán)重排序為柚皮苷>沒食子酸>綠原酸>對羥基苯甲酸>芥子酸>咖啡酸>新橙皮苷>阿魏酸。

2.4.2 Critic法分析

Critic法是由Diakoulaki等[16]提出的另一種客觀權(quán)重賦權(quán)的方法。該方法基于評價指標(biāo)的對比強度和指標(biāo)之間的沖突性來綜合衡量指標(biāo)的客觀權(quán)重。對比強度，是指同一個指標(biāo)各個評價方案之間取值差距的大小，以標(biāo)準(zhǔn)差的形式來表現(xiàn)；指標(biāo)之間的沖突性，以指標(biāo)之間的相關(guān)性為基礎(chǔ)，若2個評價指標(biāo)之間具有較強的正相關(guān)性，則這2個指標(biāo)的沖突性較低。用Cj表示第個評價指標(biāo)所包含的信息量，值越大，說明其所包含的信息量越大，則其權(quán)重(ωj)亦越大。

表6各指標(biāo)的權(quán)重(熵權(quán)法)

Table6Index weights (Entropy weight method)

樣品SampleEjωj綠原酸Chlorogenicacid0.99430.1284咖啡酸Caffeicacid0.99790.0477阿魏酸Ferulicacid0.99850.0345芥子酸Sinapicacid0.99680.0708沒食子酸Gallicacid0.98690.2927對羥基苯甲酸p-Hydroxybenzoicacid0.99620.0847柚皮柑Naringin0.98680.2960新橙皮苷Neohesperidin0.99800.0453

由表7可知，沒食子酸權(quán)重值最大(0.252 2)，其次為柚皮苷(0.206 2)、綠原酸(0.195 8)，阿魏酸權(quán)重最小(0.025 1)。所得指標(biāo)權(quán)重排序為沒食子酸>柚皮苷>綠原酸>對羥基苯甲酸>咖啡酸>芥子酸>新橙皮苷>阿魏酸。

2.4.3 Critic法與熵權(quán)法結(jié)合分析

Critic和熵權(quán)法計算指標(biāo)權(quán)重都屬于客觀賦權(quán)的方法，其中，熵權(quán)法主要表現(xiàn)指標(biāo)數(shù)據(jù)的離散性，Critic法則既兼顧到指標(biāo)數(shù)據(jù)的相關(guān)性，又考慮到數(shù)據(jù)之間的對比強度。如果將這2種方法相結(jié)合，則可以充分考慮到數(shù)據(jù)的離散性、相關(guān)性和對比強度，是一種更加完善的進(jìn)行客觀賦權(quán)的方法，計算公式如下：

(1)

式(1)中：ωj是第j個指標(biāo)權(quán)重；qij是指標(biāo)i與j的相關(guān)系數(shù)；σj是指標(biāo)j的標(biāo)準(zhǔn)差；ej是指標(biāo)j的熵。

基于Critic法與熵權(quán)法相結(jié)合的權(quán)重賦值結(jié)果如表8所示，沒食子酸權(quán)重值最大(0.195 2)，其次為新橙皮苷(0.178 3)、綠原酸(0.140 3)，芥子酸權(quán)重值最小(0.075 5)。所得指標(biāo)權(quán)重排序依次為沒食子酸>新橙皮苷>綠原酸>阿魏酸>對羥基苯甲酸>柚皮苷>咖啡酸>芥子酸。

表7各指標(biāo)的權(quán)重(Critic法)

Table7Index weights (Critic method)

樣品SampleCjωj綠原酸Chlorogenicacid1.36830.1958咖啡酸Caffeicacid0.45210.0647阿魏酸Ferulicacid0.17550.0251芥子酸Sinapicacid0.23980.0343沒食子酸Gallicacid1.76250.2522對羥基苯甲酸p-Hydroxybenzoicacid1.34220.1921柚皮柑Naringin1.44090.2062新橙皮苷Neohesperidin0.20710.0296

表8各指標(biāo)的權(quán)重(基于Critic與熵權(quán)法的客觀賦權(quán)法)

Table8Index weights (Objective weighting method based on Critic and Entropy method)

樣品Sampleωj綠原酸Chlorogenicacid0.1403咖啡酸Caffeicacid0.0850阿魏酸Ferulicacid0.1172芥子酸Sinapicacid0.0755沒食子酸Gallicacid0.1952對羥基苯甲酸p-Hydroxybenzoicacid0.1075柚皮柑Naringin0.1009新橙皮苷Neohesperidin0.1783

2.4.4 灰色關(guān)聯(lián)度分析

將灰色關(guān)聯(lián)分析與客觀賦權(quán)法相結(jié)合，可以克服采用專家賦權(quán)法等主觀賦權(quán)的不確定性。對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行以下處理：根據(jù)實際情況，確定黃果柑主要酚類物質(zhì)的理想值為參試施肥處理的最高值，組成參考數(shù)列X0。為便于分析，采用初值化法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理。求關(guān)聯(lián)系數(shù)，進(jìn)而分別計算求得關(guān)聯(lián)度和關(guān)聯(lián)序。對于不同酚類物質(zhì)，其相對重要程度不同，采用基于Critic與熵權(quán)法的客觀賦權(quán)法的結(jié)果賦予關(guān)聯(lián)系數(shù)不同的權(quán)重值ωj，加權(quán)關(guān)聯(lián)度對各施肥處理進(jìn)行評價，結(jié)果見表9。B1處理的關(guān)聯(lián)度最大，最接近參考數(shù)列，即各酚類物質(zhì)在B1處理下都具有較高含量，其次為B2和A1處理。

表9不同施肥處理的關(guān)聯(lián)度

Table9Relational grade of different fertilizer treatments

處理Treatment關(guān)聯(lián)度RelateddegreeA10.8028A20.6518A30.6187B10.9122B20.8859B30.7447C10.5426C20.5690C30.7505

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，有機肥、無機肥、有機無機復(fù)混肥的施用量對黃果柑酚類物質(zhì)含量的影響不僅與肥料中氮磷含量密切相關(guān)，還與肥料種類相關(guān)。單施無機肥時，低水平的氮磷施入量較有利于酚酸和類黃酮物質(zhì)的積累，這與Copley等[10]、Strissel等[22]的研究結(jié)果一致。單施有機肥時，適量或低水平有機肥對增加果實中酚酸含量的效果較好，但當(dāng)施用高水平有機肥時效果不理想，而適量或高水平有機肥對增加果實中類黃酮物質(zhì)的效果較好，施用低水平有機肥時效果不明顯。有機無機復(fù)混肥的用量則以高水平較好，能顯著增加果肉中酚酸和類黃酮物質(zhì)含量。本研究在黃果柑果肉中未檢測到柚皮素，與張元梅[14]結(jié)果一致。

為準(zhǔn)確評價不同施肥處理對黃果柑果實酚類物質(zhì)的影響，本研究利用基于Critic與熵權(quán)法的客觀賦權(quán)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果顯示，施用低水平的有機肥對黃果柑果肉中酚類物質(zhì)含量的提高效果最好，施用適量有機肥和低水平氮磷無機肥的效果次之。因此，在生產(chǎn)實際中，建議適當(dāng)減少無機肥中氮磷施用量，或適當(dāng)增施有機肥和有機無機復(fù)混肥，以增加黃果柑果肉中酚類物質(zhì)含量。本研究未涉及不同施肥水平對黃果柑果實發(fā)育和果實品質(zhì)的影響，在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合不同施肥水平對酚類物質(zhì)、果實生長發(fā)育及果實品質(zhì)的影響，全面分析，以確定最適肥料種類和施肥量。

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