張冬陽　羅伏鋼　王晟東　劉文娟　胡霖霖　李梅　張永華　李靜　章隆　宋明芬

[摘要] 目的 研究抑郁模型大鼠腦脊液miR-16是否能反映中縫核miR-16水平的變化，并與中縫核5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（serotonin transporter，SERT）的表達(dá)相關(guān)。方法 將20只SD大鼠隨機分為抑郁模型組和對照組，每組各10只。抑郁模型組大鼠接受21 d不可預(yù)知溫和應(yīng)激的刺激，對照組大鼠正常飼養(yǎng)。收集大鼠腦脊液測定miR-16，分離中縫核測定miR-16和SERT蛋白。比較模型組與對照組腦脊液miR-16、中縫核miR-16、SERT表達(dá)差異并分析三者的關(guān)聯(lián)性。 結(jié)果 模型組大鼠腦脊液miR-16水平（0.19±0.10）和中縫核miR-16水平（0.65±0.22）均低于相應(yīng)的對照組（0.35±0.12、0.84±0.18）（P<0.01），中縫核SERT水平（0.99±0.29）高于對照組（0.59±0.18）（P=0.002）。腦脊液miR-16與中縫核miR-16呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.95，P=0.000），而且腦脊液miR-16與中縫核miR-16一樣，與中縫核SERT呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.91，P=0.000）。 結(jié)論 抑郁模型大鼠腦脊液miR-16水平能反映中縫核miR-16水平，并與中縫核SERT表達(dá)相關(guān)，可能可作為抑郁癥的生物標(biāo)記物。

[關(guān)鍵詞] 抑郁模型;miR-16;5-羥色胺轉(zhuǎn)運體;腦脊液;中縫核

[中圖分類號] R74? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）34-0029-05

抑郁癥已成為僅次于心血管疾病的全球第二大死因和疾病負(fù)擔(dān)[1]。然而，其發(fā)病機制尚不清楚。目前的研究表明，microRNAs（miRNAs）可能參與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展[2，3]。miRNAs是體內(nèi)非編碼的小分子RNA，它們可與其靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，引起mRNA降解或者翻譯抑制[4，5]。miRNAs屬于表觀遺傳學(xué)的范疇，在生物發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6-8]。miR-16被認(rèn)為是參與抑郁癥的重要miRNAs之一，其靶基因是5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（serotonin transporter，SERT）基因，SERT是調(diào)節(jié)腦組織內(nèi)5-HT神經(jīng)遞質(zhì)功能的重要生物分子[9]。研究表明，抑郁模型動物的腦脊液miR-16水平存在異常[10，11]，但是尚不清楚腦脊液miR-16如何參與抑郁癥的發(fā)生與發(fā)展。本次實驗探討腦脊液miR-16與中縫核miR-16及其靶基因SERT的關(guān)聯(lián)性，為闡明抑郁癥的發(fā)病機制以及尋找抑郁癥生物標(biāo)志物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）級Sprague Dawley（SD）成年雌性大鼠20只[購買自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動物合格證號：SCXK（浙）2014-0001]，按隨機數(shù)字表法分成兩組：對照組和抑郁模型組，每組各10只。

1.2 方法

抑郁模型組采用21 d慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激法建立大鼠抑郁模型，建模期間該組每只大鼠均經(jīng)7種不可預(yù)知溫和應(yīng)激各3次，每天1種，21 d完成建模。7種應(yīng)激分別為：禁食24 h、4℃冰水浴中游泳5 min、束縛限制行動2 h、禁水24 h、晝夜跌倒、高空（離地面1 m）懸尾10 min、腳底電擊2次（800 mA持續(xù)1 s，每10 秒電擊1次）。對照組大鼠不接受任何應(yīng)激，自由攝食飲水。

1.3 抑郁行為評定

1.3.1 糖水消耗實驗? 將每只大鼠單籠飼養(yǎng)。建模應(yīng)激前和應(yīng)激后各測1次，每次3 d。第1天每只大鼠給予1%蔗糖水2瓶（200 mL/瓶）進(jìn)行訓(xùn)練;第2天將其中1瓶1%蔗糖水換成等量自來水;第3天禁水23 h，然后給予200 mL的1%蔗糖水和自來水各1瓶，1 h后，分別測定各瓶所剩蔗糖水或自來水的體積，即可得出每只大鼠1 h內(nèi)飲用蔗糖水和自來水的量，并根據(jù)以下公式計算糖水消耗率。糖水消耗率=糖水消耗量/（糖水消耗量+自來水消耗量）×100%。

1.3.2 曠場實驗? 建模應(yīng)激前與應(yīng)激后各測定1次。采用諾達(dá)斯行為學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行測定，Etho Vision XT軟件進(jìn)行分析。曠場實驗容器的長寬高分別100 cm×100 cm×40 cm，內(nèi)壁黑色，將底部分為20 cm×20 cm面積相等的25格，容器正上方裝有攝像頭記錄動物的行為軌跡。將大鼠放入容器中央，紀(jì)錄5 min內(nèi)水平得分和垂直得分。水平得分定為大鼠至少有3只爪子進(jìn)入容器底同一個20 cm×20 cm面積格子的次數(shù)，垂直得分定為大鼠兩只前爪離地或兩只前爪攀附桶壁的次數(shù)。曠場實驗在安靜黑暗環(huán)境進(jìn)行，每測試完1只大鼠，均清理大鼠排泄物，并用70%酒精擦拭去除可能留下的味道。

1.4 腦脊液、中縫核組織的取材

在大鼠麻醉后，在大鼠頭頸部切一約2 cm的縱行切口，鈍性分離頸部背側(cè)肌肉，暴露枕骨大孔，將大鼠頭高腳低固定，用1 mL注射器將針頭由枕骨大孔刺入，小心抽取腦脊液約0.1 mL。然后斷頭處死大鼠，分離中腦置于冰上，迅速切取中縫核。腦脊液和中縫核置-80℃冰箱保存待測。

1.5 中縫核SERT蛋白測定

采用Western blot法測定，參照Baudry A等[9]方法進(jìn)行。首先，使用膜蛋白提取試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國）提取中縫核膜蛋白，并且通過Bradford法對蛋白進(jìn)行定量。抗SERT一抗，抗β-actin一抗以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自Santa Cruz公司（加拿大）。結(jié)果分析使用ChemiDoc TM XRS+系統(tǒng)（美國Bio-rad公司），并將其與β-actin進(jìn)行校正。

1.6 腦脊液和中縫核miR-16測定

采用實時熒光定量PCR法測定。首先，提取腦脊液、中縫核總RNA（北京天根生化科技有限公司），取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，隨后進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增。目的基因miR-16的上游引物與其本身序列一樣，為5-TAGCAGCACGTAAATTGGCG-3。將U6做為校正基因，上游引物序列為5-ACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCAT-3。miR-16與U6的下游引物相同，由試劑盒自帶[miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green），北京天根生化科技有限公司]。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性 2 min，94℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次。根據(jù)擴增曲線獲得Ct值，并將其用對應(yīng)的U6值進(jìn)行校正。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。糖水消耗率、曠場實驗水平得分垂直得分、腦脊液miR-16、中縫核miR-16、中縫核SERT水平為計量資料，對照組與模型組之間的比較采用獨立樣本t檢驗;腦脊液miR-16、中縫核miR-16、中縫核SERT水平為連續(xù)型計量資料，其相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑郁行為學(xué)指標(biāo)結(jié)果

應(yīng)激前，對照組和模型組糖水消耗率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），對照組和模型組之間曠場實驗水平得分和垂直得分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。應(yīng)激后，模型組大鼠糖水消耗率明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。曠場實驗中，模型組的水平得分和垂直得分分別與對照組比較，均表現(xiàn)出較低的水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 miR-16和SERT水平比較

腦脊液miR-16比較：模型組miR-16水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.83，P=0.001）。中縫核miR-16比較：模型組miR-16水平顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.00，P=0.008）。中縫核SERT比較：模型組SERT水平顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.71，P=0.002）。見表2。

表2? ?腦脊液與中縫核miR-16或SERT測定結(jié)果比較（x±s）

2.3 腦脊液miR-16與中縫核miR-16的相關(guān)性

腦脊液miR-16和中縫核miR-16之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系（對照組r=0.69，P=0.03;模型組r=0.95，P=0.000），見圖1。

2.4 中縫核miR-16與中縫核SERT蛋白表達(dá)的相關(guān)性

對照組的中縫核miR-16水平與該組織的SERT蛋白之間有顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.62，P=0.04）;同時，模型組的中縫核miR-16水平與該組織的SERT蛋白之間也有明顯的負(fù)相關(guān)（r=-0.85，P=0.002）。見圖2。

2.5 腦脊液miR-16與中縫核SERT蛋白的相關(guān)性

腦脊液miR-16與中縫核SERT呈顯著負(fù)相關(guān)（對照組r=-0.89，P=0.000;模型組r=-0.91，P=0.000），見圖3。

3 討論

有研究顯示，動物抑郁模型以及抑郁患者自殺后的腦組織中miRNAs的表達(dá)發(fā)生了改變，提示miRNAs參與了腦組織的發(fā)育與功能發(fā)揮[12，13]。如Smalheiser NR[13]指出，與健康對照比較，無藥物治療史的抑郁癥患者腦組織miRNAs呈現(xiàn)全面下降，幾乎每個患者均有約17%的下降。

腦脊液由脈絡(luò)叢產(chǎn)生，分泌至腦室和蛛網(wǎng)膜下腔，其成分變化可能反映腦組織中某些物質(zhì)的變化，并可能作為某些疾病的生物標(biāo)志物[14-17]。例如，腦脊液中神經(jīng)絲蛋白輕鏈水平可提示神經(jīng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)元死亡和軸突退行性病變[18]。另外，研究者指出，腦脊液中某些蛋白質(zhì)可作為抑郁癥的生物標(biāo)志物，如非編碼的長RNA[19]、14-3-3蛋白[20]、腦源性神經(jīng)生長因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）[21]和某些miRNAs[22]等。其中，腦脊液miR-16在抑郁癥患者腦脊液中顯著低于健康正常人，提示腦脊液miR-16可能與抑郁癥十分相關(guān)[11]。但是，腦脊液miR-16能否反映抑郁癥腦組織中的miR-16水平并作為生物標(biāo)志物，目前尚未有相關(guān)報道。

miR-16對5-HT系統(tǒng)的影響主要是miR-16對SERT基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，從而造成突觸間隙5-HT水平的改變[23-25]。2010年，Baudry A等[9]在Science上首次發(fā)表論文稱，1C11神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞系分化成分泌去甲腎上腺素的細(xì)胞系（1C11NE）后，其miR-16表達(dá)水平比分化成分泌5-HT的細(xì)胞系（1C115-HT）低，該現(xiàn)象造成了1C11NE細(xì)胞系SERT合成增加[7]。人肺癌上皮細(xì)胞A549細(xì)胞系實驗亦揭示，miR-16以SERT為靶基因，通過下調(diào)該基因的表達(dá)而影響5-HT遞質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[26]。后來，Moya PR等[27]在人胎盤絨膜癌細(xì)胞系JAR細(xì)胞以及大鼠中縫核神經(jīng)元細(xì)胞系RN46A細(xì)胞中亦發(fā)現(xiàn)miR-16對SERT蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

中縫核因聚集5-羥色胺能神經(jīng)元，其主要功能是產(chǎn)生遞質(zhì)5-HT[28]，有文獻(xiàn)報道，5-HT重吸收的選擇性抑制劑通過提高中縫背核細(xì)胞外的5-HT水平，有明顯的抗抑郁效果，已被廣泛用于抗抑郁治療[29]。氟西汀是臨床上常用的抗抑郁藥，其療效機制為抑制SERT的功能，增加突觸間隙的5-HT濃度，從而增強腦組織5-HT功能，產(chǎn)生其藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，將氟西汀注入中縫核，與注射前比較，發(fā)現(xiàn)了該區(qū)miR-16的升高以及SERT蛋白的降低[9]，提示氟西汀抑制SERT功能有可能通過中縫核miR-16介導(dǎo)。另外，向大鼠中縫核注入miR-16，可觀察到抑郁模型小鼠抑郁樣行為的改善現(xiàn)象[9]。由此可見，中縫核是miR-16調(diào)節(jié)SERT蛋白的表達(dá)的重要部位，而且，miR-16可能通過影響中縫核5-HT功能發(fā)揮其在抗抑郁藥療效以及抑郁癥發(fā)病機制中的作用。

本次實驗建立大鼠抑郁模型，測定了腦脊液miR-16、中縫核miR-16以及中縫核SERT水平，將其與對照組進(jìn)行比較，并分析三者的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明，腦脊液miR-16、中縫核miR-16均低于對照組，而中縫核SERT高于對照組。另外，腦脊液miR-16與中縫核miR-16呈顯著正相關(guān)，并且腦脊液miR-16與中縫核miR-16一樣，與中縫核SERT蛋白水平呈顯著負(fù)相關(guān)。本次實驗結(jié)果進(jìn)一步支持Baudry A等[9]在Science發(fā)表的觀點。

本研究存在的不足：一、未探索抑郁模型大鼠腦脊液miR-16水平改變的可能原因;二、根據(jù)前期的研究報道以及我們團隊的研究結(jié)果，本次實驗只分析了腦脊液miR-16與中縫核miR-16、SERT的相關(guān)性，未對腦脊液與其他腦組織的相關(guān)性進(jìn)行分析。

綜上所述，腦脊液miR-16水平可反映中縫核miR-16水平，進(jìn)而與中縫核SERT基因表達(dá)相關(guān)，并且其有望作為抑郁癥的生物標(biāo)志物之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 施慎遜，陳致宇，張斌，等. 全球抑郁癥研究最新進(jìn)展[J].中國醫(yī)師雜志，2015，17（z2）：229-232.

[2] Hu Z，Jiang Y，Huo X，et al. Prospective role of microRNAs in depression[J]. Curr Med Chem，2017，24（32）：3508-3521.

[3] 徐寧，張廣芬. 抑郁癥的表觀遺傳學(xué)機制研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2016，29（10）：1093-1096.

[4] Awan HM，Shah A，Rashid F，et al. Primate-specific long Non-coding RNAs and MicroRNAs[J]. Genomics Proteomics Bioinformatics，2017，15（3）：187-195.

[5] 路玉盼，董憲喆，陳超，等. MicroRNAs參與調(diào)控5-羥色胺系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2017，23（5）：838-842.

[6] Bielefeld P，Mooney C，Henshall DC，et al. miRNA-Mediated regulation of adult hippocampal neurogenesis; Implications for epilepsy[J]. Brain Plast，2017，3（1）：43-59.

[7] Dolati S，Marofi F，Babaloo Z，et al. Dysregulated network of miRNAs involved in the pathogenesis of multiple sclerosis[J]. Biomed Pharmacother，2018，104：280-290.

[8] Vaishya S，Sarwade RD，Seshadri V. MicroRNA，Proteins，and metabolites as novel biomarkers for prediabetes，diabetes，and related complications[J]. Front Endocrinol（Lausanne），2018，9：180.

[9] Baudry A，Mouillet-Richard S，Schneider B，et al.miR-16 targets the serotonin transporter：A new facet for adaptive responses to antidepressants[J]. Science，2010，329（5998）：1537-1541.

[10] 宋明芬，王玉文，董介正，等. 抑郁模型大鼠不同部位miR-16表達(dá)及其與5-羥色胺轉(zhuǎn)運體的關(guān)聯(lián)性研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2015，44（10）：42-46.

[11] Song MF，Dong JZ，Wang YW，et al. CSF miR-16 is decreased in major depression patients and its neutralization in rats induces depression-like behaviors via a serotonin transmitter system[J]. J Affect Disord，2015，178：25-31.

[12] Dwivedi Y，Roy B，Lugli G，et al. Chronic corticosterone-mediated dysregulation of microRNA network in prefrontal cortex of rats：Relevance to depression pathophysiology[J]. Translational Psychiatry，2015，5（11）：e682.

[13] Smalheiser NR，Lugli G，Rizavi HS，et al. MicroRNA expression is down-regulated and reorganized in prefrontal cortex of depressed suicide subjects[J]. PloS One，2012，7（3）：e33201.

[14] Marques TM，Kuiperij HB，Bruinsma IB，et al. MicroRNAs in cerebrospinal fluid as potential biomarkers for Parkinsons disease and multiple system atrophy[J]. Molecular Neurobiology，2017，54（10）：7736.

[15] Alexandrov PN，Dua P，Hill JM，et al. microRNA（miRNA） speciation in Alzheimers disease（AD）cerebrospinal fluid （CSF） and extracellular fluid（ECF）[J]. International Journal of Biochemistry & Molecular Biology，2012，3（4）：365.

[16] Gallego JA，Gordon ML，Claycomb K，et al. In vivo MicroRNA detection and quantitation in cerebrospinal fluid[J].Journal of Molecular Neuroscience，2012，47（2）：243-248.

[17] Baraniskin A，Kuhnhenn J，Schlegel U，et al. Identification of microRNAs in the cerebrospinal fluid as biomarker for the diagnosis of glioma[J]. Neuro-oncology，2012，14（1）：29.

[18] Scherling CS，Hall T，Berisha F，et al. CSF neurofilament concentration reflects disease severity in frontotemporal degeneration[J]. Annals of Neurology，2014，75（1）：116.

[19] Cui X，Sun X，Wei N，et al. Long Non-Coding RNA： Potential diagnostic and therapeutic biomarker for major depressive disorder[J]. Medical Science Monitor International Medical Journal of Experimental & Clinical Research，2016，22：5240-5248.

[20] 王昕，陳琳，戴建國，等. 14-3-3蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病中的作用研究進(jìn)展[J]. 山東醫(yī)藥，2016，56（32）：110-112.

[21] Wenzler S，Knochel C，Balaban C，et al. Integrated biomarkers for depression in Alzheimer's disease：A critical review[J].Curr Alzheimer Res，2017，14（4）：441-452.

[22] Wan Y，Liu Y，Wang X，et al. Identification of differential MicroRNAs in cerebrospinal fluid and serum of patients with major depressive disorder[J]. PloS One，2015，10（3）：e0121975.

[23] Liao XJ，Mao WM，Wang Q，et al. MicroRNA-24 inhibits serotonin reuptake transporter expression and aggravates irritable bowel syndrome[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications，2016，469（2）：288-293.

[24] Zurawek D，Kusmider M，F(xiàn)aron-Gorecka A，et al. Reciprocal microRNA expression in mesocortical Circuit and its interplay with serotonin transporter define resilient rats in the chronic mild stress[J]. Molecular Neurobiology，2016，54（8）：1-11.

[25] Yang Y，Hu Z，Du X，et al. miR-16 and fluoxetine both reverse autophagic and apoptotic change in chronic unpredictable mild stress model Rats[J]. Front Neurosci，2017， 11：428.

[26] Tamarapu Parthasarathy P，Galam L，Huynh B，et al. MicroRNA 16 modulates epithelial sodium channel in human alveolar epithelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2012，426（2）：203-208.

[27] Moya PR，Wendland JR，Salemme J，et al. miR-15a and miR-16 regulate serotonin transporter expression in human placental and rat brain raphe cells[J]. Int J Neuropsychopharmacol，2013，16（3）：621-629.

[28] 呂帥國，盧錫華，李廷坤，等. 氯胺酮對抑郁小鼠中縫核色氨酸羥化酶2表達(dá)的影響[J]. 中華麻醉學(xué)雜志，2017，37（6）：674-677.

[29] 楊宏波，張繼川. 外側(cè)韁核在抑郁癥中的作用研究進(jìn)展[J]. 中國老年學(xué)雜志，2016，36（5）：1246-1249.

（收稿日期：2018-07-05）