鐘亞珍 林賢雷 陸金華 林勝友

[摘要] 目的 初步探討龜鹿二仙膠通過降低腫瘤周圍T淋巴細胞PD-1表達，抑制T細胞凋亡，從而抑制腫瘤生長的分子機制。 方法 采用皮下接種H22肝癌細胞株方法建立荷瘤小鼠模型，觀察藥物干預(yù)后各組荷瘤小鼠腫瘤的生長速度，Annexin V/PI雙染色法測定小鼠脾臟T淋巴細胞凋亡比例，分離腫瘤浸潤性T淋巴細胞，流式細胞檢測PD-1陽性細胞的比例。 結(jié)果 （1）龜鹿二仙膠呈劑量依賴抑制皮下瘤的生長，順鉑組及高、中、低劑量組抑瘤率分別為81.36%、79.64%、48.86%、21.96%;（2）順鉑組及高、中、低劑量組小鼠T淋巴細胞凋亡比例分別為早期（24.37±0.32）%、（5.30±0.21）%、（6.90±0.16）%、（11.93±2.01）%;晚期（8.83±1.23）%、（4.73±0.33）%、（6.40±0.34）%、（7.47±0.54）%，說明與順鉑組比較，龜鹿二仙膠能夠抑制小鼠T淋巴細胞凋亡;（3）龜鹿二仙膠高劑量組、中劑量組的PD-1表達陽性細胞比分別為（11.73±0.54）%、（20.00±0.66）%，明顯低于生理鹽水組（32.57±0.65）%和順鉑組（31.83±0.43）%，說明龜鹿二仙膠能夠降低腫瘤浸潤T淋巴細胞中PD-1陽性的比例。 結(jié)論 龜鹿二仙膠具有抑制腫瘤生長的作用，其機制可能是通過抑制PD-1表達，減少T淋巴細胞凋亡，增強機體免疫力，從而抑制和殺傷腫瘤細胞得以實現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 龜鹿二仙膠;T淋巴細胞;PD-1;凋亡

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）36-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of Guilu Erxianjiao in inhibiting tumor growth and inhibiting T cell apoptosis by reducing the expression of PD-1 in T lymphocytes around the tumor. Methods The tumor-bearing mouse model was established by subcutaneous inoculation of H22 hepatoma cell line. The growth rate of tumor-bearing mice in each group was observed after drug intervention. Annexin V/PI double staining was used to detect the percentage of apoptosis of mouse spleen T lymphocytes. Tumor infiltrating T lymphocytes were isolated. The proportion of PD-1 positive cells was detected by flow cytometry. Results （1）Guilu Erxianjiao inhibited the growth of subcutaneous tumors in a dose-dependent manner. The tumor inhibition rate of cisplatin group and high， medium and low dose groups was 81.36%， 79.64%， 48.86% and 21.96%， respectively. （2）The percentages of T lymphocyte apoptosis in the cisplatin group， high， medium and low dose groups were early （24.37±0.32）%， （5.30±0.21）%， （6.90±0.16）%， （11.93±2.01）%， and late （8.83±1.23）%， （4.73±0.33）%， （6.40±0.34）%， （7.47±0.54）%， indicating that compared with cisplatin group， Guilu Erxianjiao could inhibit the apoptosis of mouse T lymphocytes. （3）The ratio of PD-1 positive cells in Guilu Erxianjiao high dose group and medium dose group of was（11.73±0.54）% and （20.00±0.66）%， which was significantly lower than that in the saline group （32.57±0.65）% and cisplatin group （31.83±0.43）%， indicating that Guilu Erxianjiao could reduce the proportion of PD-1 positive in tumor infiltrating T lymphocytes. Conclusion Guilu Erxianjiao has the effect of inhibiting tumor growth. This may be achieved by inhibiting PD-1 expression， reducing T lymphocyte apoptosis， enhancing immunity to inhibit and kill tumor cell.

[Key words] Guilu Erxianjiao; T lymphocytes; PD-1; Apoptosis

近年來，隨著對腫瘤免疫逃逸機制的深入了解，通過阻斷程序性死亡蛋白1（programmed cell death 1，PD-1）及其配體1（PD-1 ligand，PD-L1）構(gòu)成的PD-1/PD-L1通路、重新激活機體免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用成為了一種新的腫瘤治療策略[1-2]。PD-1/PD-L1抑制劑目前適用于多種類型腫瘤，但總體治療人群有效率在20%左右[3]，雙抗以及和放化療、抗血管治療藥物的聯(lián)合治療一定程度提高了腫瘤治療反應(yīng)率，但也伴有較高的副作用，與此同時，獲得性耐藥也是目前免疫治療的難點。

課題組前期基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠可以有效抑制化療小鼠脾臟T淋巴細胞凋亡，對患者的免疫功能具有一定的保護作用[4]，進一步研究龜鹿二仙膠的免疫調(diào)節(jié)作用，本研究通過建立荷瘤小鼠模型，觀察化療及中藥治療后小鼠T淋巴細胞凋亡情況及腫瘤浸潤性T淋巴細胞中PD-1陽性細胞的比例，初步探討其可能的抗腫瘤效應(yīng)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

6～8周齡健康的SPF級近交系小鼠（從上海西普爾-必凱實驗動物有限公司購得），生產(chǎn)許可證號：SCXK（*）2012-0002，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為18℃～29℃，日溫差≤3℃，相對濕度達40%～70%，晝夜明暗交替。

1.2 藥物和細胞株

按龜板膠6 g、鹿角膠9 g、枸杞子15 g、生曬參9 g比例組成復(fù)方，中藥飲片由杭州市腫瘤醫(yī)院中藥房采購，委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所制劑，根據(jù)“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算等效劑量方法，煎汁，過濾，濃縮至100%濃度，使每毫升含生藥1 g，分裝，置4℃冰箱備用。順鉑粉劑購自杭州市腫瘤醫(yī)院藥房（批號：1WA2A160100）。H22肝癌細胞購自中科上海細胞庫。

1.3 試劑

青鏈霉素混合液（100X）購自Solarbio公司（貨號：P1400-100）;淋巴細胞分離液購自CEDARLANE公司（貨號：CL5020）;胎牛血清購自GIBCO公司（貨號：16000-044）;RMPI-1640購自Hyclone公司（貨號：SH30809.01B）;Anti-PD1 antibody 購自Abcam公司（貨號：ab95791）;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號：C1062）。

1.4 主要儀器

離心機為上海盧湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品，顯微鏡為上海蔡康光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，CO2恒溫培養(yǎng)箱為Thermo產(chǎn)品，流式細胞儀為BD產(chǎn)品。

1.5 細胞培養(yǎng)

H22肝癌細胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2 濃度和100% 濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 建立荷瘤小鼠模型

選用正常傳代的H22肝癌細胞，接種于小鼠腹腔，無菌取腹水，用PBS稀釋成腫瘤細胞懸液，離心收集細胞，待腹水生成后抽取腹水，調(diào)整細胞濃度為1.5×107個/mL。將H22細胞200 μL（3×106個）接種于小鼠腋部皮下，大約1～2周后成瘤。

1.7分組及藥物給藥

實驗分為陰性對照組（生理鹽水組）、化療對照組（順鉑組）、龜鹿二仙膠高劑量組、龜鹿二仙膠中劑量組、龜鹿二仙膠低劑量組共5組，每組3只。

藥物干預(yù)方式：陰性對照組腹腔注射生理鹽水（0.2 mL），化療對照組腹腔注射順鉑3 mg/（kg·d），兩組均灌胃生理鹽水0.3 mL;龜鹿二仙膠高劑量組、中劑量組、低劑量組灌胃龜鹿二仙膠劑量（分別為0.38 g、0.19 g、0.095 g）：各劑量組均腹腔注射生理鹽水0.2 mL，連續(xù)給藥9 d（d1～d9）。

1.8 計算荷瘤小鼠抑瘤率

最后一次干預(yù)后24 h將小鼠脫頸椎處死，剖取腋部皮下腫瘤組織稱重，分別計算加藥組的腫瘤抑制率。公式為：腫瘤抑制率（%）=（模型組平均瘤重-藥物干預(yù)組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。

1.9 流式細胞術(shù)檢測藥物對細胞凋亡率的影響

脾切除后，用PBS漂洗2～3次，于5 mL離心管中剪成碎泥狀后過細胞篩，PBS沖洗2～3次，收集濾液。離心后收集單核細胞層并用PBS洗滌3次，PBS重懸制備成1×108個/mL單核細胞懸液。每100 μL細胞加入20 μL CD3+磁珠抗體，4℃孵育15 min后buffer（PBS、0.5% FBS）洗滌2次，用500 μL buffer重懸細胞（細胞數(shù)≤108），并于磁場中分選（4℃）。潤洗，將細胞懸液過柱，收集未被磁性標記的細胞，重復(fù)操作2次，所收集細胞即為CD3-T淋巴細胞。PBS洗滌2次后重懸備用。?。?～10）×104重懸的細胞，離心，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻。避光孵育10 min。離心，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞后加入10 μL碘化丙啶染色液，混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測。

1.10流式檢測腫瘤浸潤T淋巴細胞中PD-1表達陽性的比例

處死小鼠無菌條件下取得瘤體標本，除去黃色脂肪組織及血塊置于PBS緩沖液中浸泡5 min，充分剪碎，研磨制成單細胞懸液，經(jīng)小鼠淋巴細胞分離液梯度離心后收集白膜層，培養(yǎng)基重懸，置入250 mL培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱貼壁2 h。收集未貼壁細胞，其中即含有腫瘤浸潤性T淋巴細胞，PBS洗滌3次，重懸細胞后制備成單細胞懸液，之后1000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀用100 μL PBS重懸，使用抗小鼠PD-1抗體 4℃ 30 min染色后上機檢測。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件包分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料用（x±s）表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龜鹿二仙膠能夠抑制腫瘤生長

實驗表明，龜鹿二仙膠具有抑制腫瘤生長的作用，呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果顯示順鉑和高中低劑量處理組抑瘤率分別為81.36%、79.64%、48.86%、21.96%，與空白對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=165.31，P=0.013），其中順鉑組、龜鹿二仙膠高、中劑量組與生理鹽水組相比具有顯著抑制腫瘤的作用（F=218.24，P=0.008）。

2.2 龜鹿二仙膠能夠抑制荷瘤小鼠T淋巴細胞凋亡

Annexin V-FITC/PI雙染法分析顯示：與順鉑組比較，龜鹿二仙膠各劑量組小鼠T淋巴細胞早期凋亡比均減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=158.41，P=0.011），高中劑量組小鼠T淋巴細胞晚期凋亡比減少（F=156.63，P=0.018），說明龜鹿二仙膠能夠抑制荷瘤小鼠T淋巴細胞凋亡，且抑制作用與劑量呈正相關(guān)。

2.3 龜鹿二仙膠能夠降低腫瘤浸潤T淋巴細胞中PD-1陽性的比例

與生理鹽水和順鉑組比較，龜鹿二仙膠高、中劑量組的PD-1表達陽性細胞比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.08，t=18.91，P=0.014;F=1.83，t=18.37，P=0.015;F=1.76，t=17.64，P=0.016;F=1.71，t=16.93，P=0.017），且龜鹿二仙膠呈劑量依賴的方式抑制PD-1陽性T細胞的表達;生理鹽水組和順鉑組間比較PD-1表達陽性細胞比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），說明順鉑的抗腫瘤作用與調(diào)節(jié)T細胞PD-1表達不相關(guān)。

3 討論

腫瘤免疫治療是通過調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強抗腫瘤免疫力，從而抑制和殺傷腫瘤細胞，以PD-1抗體、PD-L1抗體為代表的免疫檢查點抑制劑是目前臨床研究的熱點。程序性死亡受體1（programmed cell death-1，PD-1）存在PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）兩個配體，可與T細胞表面受體PD-1結(jié)合，在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要的負調(diào)節(jié)作用[5]。PD-1是一種重要的免疫檢查點，可廣泛表達于多種細胞，例如B細胞、T細胞以及NK/T細胞等[6-8]，腫瘤細胞表面往往具有異常高表達的PD-L1分子，與腫瘤浸潤T淋巴細胞表面的PD-1分子結(jié)合，在腫瘤微環(huán)境中抑制T細胞活化的免疫應(yīng)答，避免腫瘤細胞被T細胞殺傷，最終實現(xiàn)腫瘤的免疫逃逸[9-10]。而抗PD-1或PD-L1抗體能夠阻斷腫瘤表面PD-L1和T細胞表面PD-1的結(jié)合，消除這一免疫抑制效應(yīng)，使得T細胞重新被激活，識別并殺傷癌細胞[11-13]。在腫瘤部位，抗PD-1抗體還可以結(jié)合巨噬細胞表面的Fcγ受體，介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞的消耗，從而上調(diào)T細胞的比例，增強抗腫瘤能力[14]。

現(xiàn)代藥理表明，益氣養(yǎng)陰類中藥具有免疫調(diào)節(jié)作用[15-17]。龜鹿二仙膠為中醫(yī)傳統(tǒng)古方，該方由鹿角膠、龜板、人參、枸杞子四味藥物組成，《醫(yī)方考》、《古今名醫(yī)方論》認為其具有大補元氣、益精生血、陰陽并補之效。相關(guān)實驗結(jié)果表明龜鹿二仙膠具有提高細胞免疫的作用，陳萍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠聯(lián)合激素替代周期治療能夠提高卵巢早衰患者外周血中的CD3+T細胞、CD4+T細胞水平，從而提高患者免疫功能、改善患者臨床癥狀。錢鈞等[19]研究發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙湯能有效升高 CD4+，降低 CD8+，從而提高 CD4+/CD8+的比值，使免疫功能對機體抗腫瘤作用處于更有利的狀態(tài)。師林等[20]實驗結(jié)果表明用加味龜鹿二仙膠湯合用化療不僅可以縮小腫瘤病灶，還能夠調(diào)節(jié)細胞免疫功能。

結(jié)合以上，課題組提出龜鹿二仙膠可以通過恢復(fù)T細胞活性發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的假說。實驗結(jié)果顯示：龜鹿二仙膠以劑量依賴的方式抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長;同時給予龜鹿二仙膠處理后荷瘤小鼠脾臟T淋巴細胞凋亡減少，這種抑制作用具有劑量依賴性，尤其是當T淋巴細胞處于凋亡晚期時，高劑量組仍具有抑制作用。同時研究還發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠中、高劑量可以降低腫瘤浸潤T淋巴細胞中PD-1陽性的比例。

綜上所述，本研究初步顯示龜鹿二仙膠具有抑制腫瘤生長的作用，其機制可能是通過抑制PD-1表達，減少T淋巴細胞凋亡，恢復(fù)T細胞活性實現(xiàn)的，由于腫瘤免疫的過程復(fù)雜，多種機制的共同作用影響了免疫檢查點藥物的療效，具體的內(nèi)在機制有待于進一步深入研究。

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（收稿日期：2018-06-22）