（岳陽市公安局刑偵支隊 刑事科學技術研究所，湖南 岳陽 414000）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為第三代遺傳標記，在人類基因組中分布廣泛，突變率低，廣泛應用于遺傳學、藥物學、人類進化及法醫(yī)學等研究[1]。相對于STR基因座的高突變率及片段檢測要求，學者預測在未來SNP將替代STR基因座成為法醫(yī)學研究及應用的主要遺傳標記[1]。目前，法醫(yī)學常用的SNP檢測技術如SNPlex、SNapShot、Massarray等，最多只能對幾十個SNP位點同時進行檢測[1-3]，從而限制了SNP位點的廣泛使用。本研究中，HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124個體識別試劑盒作為基于二代測序Ion Torrent PGM平臺開發(fā)的第一個商業(yè)化SNP檢測試劑盒，包含90個已驗證的全球通用常染色體SNP位點和34個Y染色體系統(tǒng)發(fā)育樹上最大單倍型SNP位點。目前，該試劑盒在中國人群中的數據驗證已完成，結果顯示該試劑盒中所含有的大部分SNP位點多態(tài)性豐富[4]。本研究嘗試采用該試劑盒對日常檢案工作中無法獲取完整DNA分型的降解檢材進行檢測。

1 材料與方法

20例降解檢材均來自于岳陽市公安局刑偵支隊刑事科學技術研究所，采用QIAamp血液樣本抽提試劑盒（德國Qiagen公司）提取DNA，用QuantifilerTMHuman DNA定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行DNA定量。陽性標準品采用9948。

毛細管電泳檢測：對提取的DNA采用HuaxiaTMPlatinum PCR擴增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行23個常染色體STR基因座的檢測，具體操作詳見試劑盒說明書。PCR產物在3500xL基因分析儀（美國AB公司）上進行基因分型檢測。檢測成功基因座要求等位基因相對熒光單位（relative fluorescein unit，RFU）大于50，若為雜合子，其均衡性大于60%[4]。

二代測序檢測：采用HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124個體識別試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）對上述20份檢材進行檢測分析。具體操作為DNA文庫構建、文庫定量、乳液PCR反應、文庫富集、測序及結果分析。其中，DNA文庫構建采用Ampliseq技術及相應的Ion AmpliSeqTM2.0-96LV文庫制備試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），最終文庫構建 PCR 體系為 20 μL，含 4 μL 5× Ion AmpliSeq HiFi反應混合 液，10 μL 2× HID-Ion AmpliSeqTMIdentity Panel SNP-124引物混合物，DNA含量為10 ng以內，其余體積用去離子水補齊。文庫構建的PCR條件：99℃ 2 min；99℃ 15 s，60℃ 4 min，23個循環(huán)；產物10℃保存。擴增產物采用2μL FuPa對引物進行部分消化，并進行磷酸化。處理條件：50℃10min，55℃ 10min，60℃ 20min，10℃保存，保存時間不宜超過1h。之后，加入2μL已提前稀釋的Barcode、4 μL Switch Solution以及2 μL DNA連接酶，總反應體積為30μL。處理條件：22℃ 30min，72℃ 10min，10℃保存。產物在1h內進行純化處理或者于-20℃冷凍保存，采用實時定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）對文庫進行精確定量。乳液PCR擴增體系見表1。

按照表1將PCR體系準備好后，再加入100μL充分振蕩混勻的Ion PGMTMTemplate OT2 200 Ion SphereTMParticles（美國Thermo Fisher Scientific公司），15 min內在Ion OneTouchTM2乳液PCR儀上選擇“Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit”選項進行乳液PCR，時間約8 h。產物取出時間不超過16 h（從反應開始計時）。之后在Ion OneTouchTMES儀器（美國Thermo Fisher Scientific公司）上進行ISP磁珠富集。富集后的文庫在Ion Torrent PGM儀器（美國Thermo Fisher Scientific公司）上采用“Ion PGMTMSequencing 200 v2”程序進行測序檢測。Flow數為500。采用HID_SNP_Genotyper.42（v4.2）（美國Thermo Fisher Scientific公司）對測序數據進行分析。檢測成功位點要求測序reads數大于100，雜合子均衡性大于60%[4]。

表1 乳液PCR體系配置

2 結果與討論

陽性標準品9948采用常規(guī)毛細管電泳檢測和二代測序技術檢測均可以獲得完整的分型結果。其中，9948在23個STR基因座的分型結果與試劑盒說明書中所提供的一致，9948在124個SNP位點的分型結果與文獻[4]中提供的結果一致，表明上述方法的準確性和重復性可滿足實際工作需要。

20例降解樣本的檢測結果見表2。其中，采用毛細管電泳檢測均不能獲得完整的分型結果，檢測成功的基因座數目為5～20個，即基因座檢測成功率為21.7%～87.0%，平均檢測成功率為45.8%。對于雜合子分型，采用等位基因峰值較低與等位基因峰值較高的峰高比值進行均衡性評估，單個樣本的雜合子均衡性范圍分布為60.8%～75.6%，20個樣本的平均雜合子均衡性為66.1%。對于上述20份樣本采用二代測序的結果表明：7份樣本可以獲取完整分型，即在124個SNP位點上均有測序信號峰，且reads數大于100；對于檢測到兩個等位基因信號值的分型，采用測序信號低的等位基因reads數與測序信號高的reads數的比值進行均衡性評估，均高于60%。最低的測序成功率為1號樣本（42.0%），雜合子均衡性為78.6%，檢測到的測序數據均真實可信。20份樣本的平均檢測成功率為82.7%，平均雜合子均衡性為74.8%，相較于毛細管電泳差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 20例降解樣本采用毛細管電泳和二代測序檢測的結果

研究結果表明，當DNA發(fā)生降解時，采用常規(guī)毛細管電泳進行檢測，常發(fā)生基因座檢測不完全的現(xiàn)象，主要原因在于：毛細管電泳檢測主要依靠對片段的大小進行判別分析，在體系設計時需根據可選熒光素數量及片段的大小差異進行排列分布。當DNA發(fā)生降解時，大片段常常無法獲取有效擴增片段。本研究中HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124個體識別試劑盒中含有的SNP位點對于片段的大小無要求，可以將其設計得盡量短，其中常染色體SNP位點的平均文庫大小為132 bp，Y-SNP位點的平均文庫大小為141 bp，對其中7個降解檢材可獲取完整分型。上述結果均提示，采用二代測序及SNP位點對于降解檢材可以獲取更為豐富的遺傳信息，用于法醫(yī)學身份識別。