（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

失血性休克是一類常見的臨床危重情況，死亡率高，也是法醫(yī)病理學(xué)實(shí)踐中常見的死亡原因，主要表現(xiàn)為血壓、心率、呼吸、意識(shí)等生命功能障礙[1]。失血性休克發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制主要為有效血容量失代償性降低，導(dǎo)致全身組織缺血缺氧，特別是重要生命器官組織細(xì)胞糖類、脂類、氨基酸、維生素等物質(zhì)代謝紊亂。臨床上，輸液擴(kuò)容、升高血壓是救治失血性休克的首要措施[2]。以往認(rèn)為，盡早、盡快、充分輸液，即最短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)容升壓，恢復(fù)血壓和有效血容量，使重要器官組織得到充分灌注，可阻止休克惡化[2-4]。法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐中，有時(shí)會(huì)遇到失血性休克患者在救治過(guò)程中發(fā)生因過(guò)度輸液死亡的案例。因此，本研究擬建立家兔重度失血性休克模型，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測(cè)輸入不同量晶體液——生理鹽水救治失血性休克的情況下肝組織的代謝物譜及其療效，分析過(guò)度輸液的肝組織相關(guān)代謝因素，為法醫(yī)學(xué)死亡原因鑒定分析與機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

雄性成年家兔30只，10～12周齡，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查同意。

甲醇（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），正亮氨酸、甲氧明（純度98%）、三甲基氯硅烷（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），吡啶、二氯甲烷（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 失血性休克模型的建立

家兔適應(yīng)性常量飼養(yǎng)1周，建模前禁食12h，稱重。自耳緣靜脈注入3%戊巴比妥鈉生理鹽水（1 mL/kg）麻醉，仰臥位固定于兔臺(tái)上。在右頸總動(dòng)脈中段插入三通管，分別用于連接BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）監(jiān)測(cè)血壓、放血和注射肝素抗凝。記錄放血量，15min內(nèi)放血致血壓為5.3kPa（40mmHg）左右的重度失血性休克狀態(tài)，維持30min[5-7]。

建模成功后將家兔隨機(jī)分為未輸液、常量輸液、過(guò)度輸液3個(gè)組，每組10只。未輸液組家兔成功建立失血性休克模型后，不再做任何處理；常量輸液組以3mL/min的速度自耳緣靜脈輸入0.9%生理鹽水至血壓為12.0 kPa（90 mmHg），平均總輸液量為失血總量的3倍左右；過(guò)度輸液組以7.5 mL/min的速度持續(xù)輸液。期間，持續(xù)監(jiān)測(cè)并記錄呼吸、心率和血壓的變化，記錄各組死亡家兔的死亡時(shí)間，存活家兔至5h斷頭處死。死后立即解剖，提取肝組織，測(cè)量其質(zhì)量、體積，計(jì)算密度，并進(jìn)行大體及HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察，生理鹽水清洗后立即置于-80℃冰箱凍存終止代謝。

1.3 GC-MS檢測(cè)

各家兔取同部位肝組織40 mg置于2 mL離心管中，加入0℃甲醇（30mL/g）、100μL超純水，放入鋼球4顆（1大3小），置于提前預(yù)冷的自動(dòng)勻漿器盒內(nèi)，勻漿120s，0℃靜置10min，在4℃下以10621×g離心10min，取200 μL上清液置于GC管中，加入0.5 mmol/L正亮氨酸20μL，氮?dú)獯蹈?。加?0μL二氯甲烷，繼續(xù)吹干。加入30μL甲氧明溶液，密閉，20℃下振蕩16h，肟化。加入30μL 1%三甲基氯硅烷，20℃下振蕩1h，衍生化，取1μL上機(jī)檢測(cè)。

采用7890A氣相色譜儀與5975C單四極桿MSD聯(lián)用系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）采集數(shù)據(jù)，使用DB-5MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm，美國(guó)Agilent公司）。色譜條件：進(jìn)樣口溫度230℃，脈沖無(wú)分流，柱初始溫度為60℃，保持2min，以8℃/min程序升溫至285℃，保持10 min，柱流量為1.0 mL/min，載氣為高純氦氣。質(zhì)譜條件：接口溫度為290℃，電離方式為標(biāo)準(zhǔn)EI源（70eV），離子源溫度為230℃，選擇質(zhì)荷比（m/z）范圍為50～600。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)采用表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合方差齊性和正態(tài)分布者的兩兩比較采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法，不符合方差齊性和正態(tài)分布者采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。定性數(shù)據(jù)用率表示，進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

GC-MS數(shù)據(jù)由ChemStation軟件（美國(guó)Agilent公司）進(jìn)行記錄和導(dǎo)出，轉(zhuǎn)化為CDF格式文件，使用R語(yǔ)言生成Excel格式數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA-P軟件，偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）建模，生成分散點(diǎn)圖，判斷三組家兔代謝輪廓的差異（兩兩對(duì)比），獲得變量權(quán)重重要性排序（variable importance in projection，VIP）值，以R2X、R2Y值判斷建模的質(zhì)量，兩者越接近1說(shuō)明模型穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)性越可靠，一般情況下該值高于0.5就能說(shuō)明模型較好[8]。

每一譜峰所屬代謝物根據(jù)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫(kù)2.0進(jìn)行定性分析。對(duì)內(nèi)標(biāo)（正亮氨酸）進(jìn)行峰面積歸一化處理，獲得代謝物的相對(duì)含量，結(jié)合VIP值和Studentt檢驗(yàn)檢驗(yàn)差異顯著性；以VIP值＞0.75和（或）P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并計(jì)算差異代謝物相對(duì)含量或輸液量在兩組中的差異倍數(shù)（folder change，F(xiàn)C），F(xiàn)C值越大，差異越顯著。同時(shí)，對(duì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物含量與輸液量之間進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，Logistic回歸分析兩者與死亡的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 各組死亡率的比較

成功建立30只家兔重度失血性休克模型。未輸液組、常量輸液組及過(guò)度輸液組三組之間失血量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。過(guò)度輸液組5h觀察期間死亡率為70%（7/10），未輸液組死亡率為80%（8/10），兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均明顯高于沒(méi)有發(fā)生死亡情況的常量輸液組（P＜0.05）。

各組家兔實(shí)驗(yàn)前與死亡前的生理指標(biāo)變化見表1。實(shí)驗(yàn)前血壓、呼吸、心率在三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。死亡前，過(guò)度輸液組與未輸液組的血壓、心率均明顯低于常量輸液組（P＜0.05），過(guò)度輸液組和未輸液組均有5只家兔出現(xiàn)呼吸先停、心搏后停的腦死亡征象，占所有死亡家兔的67%（10/15）。過(guò)度輸液組平均總輸液量[（1358.80±386.08）mL]高于常量輸液組[（215.20±50.21）mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，F(xiàn)C=6.3）。未輸液組死亡時(shí)間為[（70.63±48.28）min]，過(guò)度輸液組死亡時(shí)間為[（231.71±26.76）min]，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 肝組織病理學(xué)觀察

各組肝組織平均肝質(zhì)量和密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），大體觀察和組織病理學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異性病變，詳見圖1、表2。

2.3 代謝特征分析

2.3.1 肝組織代謝輪廓分析

PLS-DA得分圖分析顯示：未輸液組-常量輸液組的R2X為0.653，R2Y為0.553；未輸液組-過(guò)度輸液組的R2X為0.351，R2Y為0.439；過(guò)度輸液組-常量輸液組的R2X為0.562，R2Y為0.739。說(shuō)明各組間PLSDA模型相對(duì)較好。三組家兔肝組織代謝輪廓兩兩區(qū)分明顯，提示各組總體代謝特征差異顯著（圖2）。

表1 各組家兔實(shí)驗(yàn)前與死亡前的生理指標(biāo)變化情況及輸液量 （n=10，±s）

表1 各組家兔實(shí)驗(yàn)前與死亡前的生理指標(biāo)變化情況及輸液量 （n=10，±s）

注：1）與實(shí)驗(yàn)前比較，P＜0.05；2）與死亡前常量輸液組比較，P＜0.05

組別未輸液常量輸液過(guò)度輸液135.70±11.4157.66±30.3737.20±8.6120.80±11.0927血壓/mmHg實(shí)驗(yàn)前133.55±11.69 129.00±12.48死亡前38.56±16.811）2）94.28±16.311）1）2）呼吸/次實(shí)驗(yàn)前35.20±8.98 35.50±6.24死亡前17.10±13.821）34.70±5.10 1）心率/次實(shí)驗(yàn)前296.60±26.19 295.60±33.25 7.90±26.73死亡前163.50±49.301）2）214.70±47.271）105.90±71.881）2）

圖1 各組家兔肝組織病理學(xué)改變

表2 各組家兔肝組織病理學(xué)改變

圖2 三組間兩兩比較的PLS-DA得分圖

2.3.2 各組肝組織差異代謝物分析

各組肝組織之間差異代謝物的相對(duì)含量見表3。過(guò)度輸液組：（1）共有21種物質(zhì)的相對(duì)含量低于常量輸液組（P＜0.05或VIP值＞0.75），肝組織物質(zhì)稀釋倍數(shù)為1.05～14.29倍；（2）共有8種物質(zhì)的相對(duì)含量低于未輸液組（VIP值＞0.75），肝組織物質(zhì)稀釋倍數(shù)為1.27～2.56倍。常量輸液組共有17種物質(zhì)的相對(duì)含量高于未輸液組（P＜0.05或VIP值＞0.75）。

表3 三組家兔肝組織差異代謝物的相對(duì)含量

2.3.3 差異代謝物的相關(guān)分析

各組肝組織的差異代謝物相對(duì)含量分別與輸液量和死亡的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，未輸液組和過(guò)度輸液組琥珀酸相對(duì)含量與死亡呈負(fù)相關(guān)（Logistic回歸分析，P＜0.05），其余代謝物與死亡無(wú)明顯相關(guān)性。常量輸液組和過(guò)度輸液組的輸液量與乳酸、乙酸、丙氨酸、尿素、琥珀酸、延胡索酸、絲氨酸、丁二酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、十七烷酸12種物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，與膽固醇呈正相關(guān)（P＜0.05），見表4。

表4 肝組織的差異代謝物與輸液量的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討 論

臨床上，大量輸液擴(kuò)充血容量和恢復(fù)血壓是救治失血性休克的常規(guī)措施[9]。在法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐中，時(shí)常遇見各類傷病因過(guò)度輸液引發(fā)循環(huán)超負(fù)荷、水中毒導(dǎo)致或促進(jìn)死亡的發(fā)生[10]。迄今，有關(guān)過(guò)度輸液的危害及其代謝機(jī)制尚不清楚。

肝組織的各類代謝底物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的代謝路徑復(fù)雜多樣，既為全身器官提供營(yíng)養(yǎng)、能量產(chǎn)物，又為其他器官解毒和排泄代謝廢物，因此，屬于機(jī)體的代謝中樞器官，其代謝狀態(tài)影響和反映全身其他器官組織的代謝情況，故本研究選擇了肝組織作為不同輸液情況下失血性休克相關(guān)代謝機(jī)制研究的靶器官。

3.1 過(guò)度輸液救治失血性休克的危害

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重度失血性休克后，以常量輸液量6.3倍左右的過(guò)度輸液量進(jìn)行救治，死亡率高達(dá)70%，與休克后未輸液救治（死亡率為80%）相比，死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而常量輸液的死亡率為0，顯著低于未輸液組和過(guò)度輸液組，證實(shí)了目前臨床常規(guī)救治失血性休克輸液量的合理性和有效性。相反，過(guò)度輸液對(duì)于失血性休克的救治有害無(wú)益，這與文獻(xiàn)[11-15]報(bào)道的過(guò)度快速輸液容易引起肺等全身器官組織水腫、電解質(zhì)平衡紊亂、繼發(fā)感染以及多器官功能障礙而死亡的結(jié)果相似?；谑澜缧l(wèi)生組織制定的《國(guó)際疾病分類》（International Classification of Diseases，ICD）死亡原因分析，單純失血性休克組與過(guò)度輸液組死亡的根本原因均應(yīng)屬于失血性休克，但是，前者的死亡機(jī)制應(yīng)為經(jīng)典的有效循環(huán)血量降低導(dǎo)致灌流不足，引起生命重要器官組織缺血缺氧的循環(huán)衰竭性代謝功能失代償，后者的死亡機(jī)制則為嚴(yán)重的血液和組織液稀釋所致生命重要組織器官各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有效代謝濃度降低的循環(huán)超負(fù)荷性水中毒，即單純失血性休克死亡屬于外傷源性，過(guò)度輸液致死屬于醫(yī)源性。

本研究死亡家兔中約67%發(fā)生呼吸先停、心搏后停的腦死亡情況，證實(shí)了生命中樞腦組織對(duì)于失血性休克的缺血缺氧最敏感，且失血性休克可導(dǎo)致直接性腦死亡[16]。

3.2 不同輸液情況下的肝組織病理學(xué)改變

未輸液組與常量輸液組的肝組織大體和組織學(xué)改變不明顯。但是，過(guò)度輸液組肝表面明顯色澤淺淡，組織病理學(xué)檢驗(yàn)見肝細(xì)胞彌漫性高度水樣變性，呈氣球樣，表明過(guò)度輸液可導(dǎo)致肝組織嚴(yán)重水腫，可作為鑒定過(guò)度輸液的病理學(xué)診斷指標(biāo)之一，這可能是過(guò)度輸液所致血液和組織液稀釋，細(xì)胞內(nèi)液膠體滲透壓明顯高于細(xì)胞外液，引發(fā)了低滲性細(xì)胞毒性水腫。

3.3 不同輸液情況下的肝組織代謝差異及其組織液稀釋

本研究發(fā)現(xiàn)，失血性休克后過(guò)度輸液救治的肝組織總體代謝輪廓與常量輸液組和未輸液組均存在明顯差異。過(guò)度輸液組家兔肝組織中有21種代謝物相對(duì)含量均低于常量輸液組（P＜0.05或VIP值＞0.75），其中8種低于未輸液組（VIP值＞0.75）。同時(shí)，12種代謝物與輸液量呈負(fù)相關(guān)，表明過(guò)度輸液可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)外液的物質(zhì)濃度顯著降低，導(dǎo)致嚴(yán)重的組織液稀釋。

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）及相關(guān)生物化學(xué)理論知識(shí)[17]，初步分析三組代謝損害的可能機(jī)制，構(gòu)建三羧酸循環(huán)抑制、脂肪酸的氧化供能抑制、鳥氨酸循環(huán)的激活等代謝路徑網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），可供探討失血性休克及其不同輸液救治情況下的死亡機(jī)制。

圖3 失血性休克后過(guò)度輸液差異代謝物的相關(guān)代謝路徑網(wǎng)絡(luò)圖

一般認(rèn)為，機(jī)體存在以下3個(gè)重要的生物化學(xué)代謝路徑[3，17]：（1）氨基酸類物質(zhì)既屬于合成各類蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)分子物質(zhì)，又屬于低營(yíng)養(yǎng)或缺血缺氧情況下通過(guò)磷酸戊糖途徑產(chǎn)生腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）生物能的重要底物，特別是其代謝路徑為底物和產(chǎn)物濃度調(diào)控的雙向反應(yīng)，即底物濃度低時(shí)，代謝路徑方向逆轉(zhuǎn)；（2）脂肪酸類物質(zhì)既屬于各類花生四烯酸及其衍生物的許多重要生物活性物質(zhì)（如前列腺素、白介素、血栓素等）的反應(yīng)底物，又屬于脂肪氧化產(chǎn)生ATP生物能的重要中間代謝物；（3）乳酸可激活肝、骨骼肌細(xì)胞的糖異生途徑，轉(zhuǎn)變成葡萄糖，進(jìn)入產(chǎn)能代謝路徑，琥珀酸本身就是三羧酸循環(huán)的重要中間物質(zhì)?；阽晁釣槿人嵫h(huán)產(chǎn)能代謝路徑中的重要中間產(chǎn)物，認(rèn)為琥珀酸濃度及其相關(guān)代謝酶活性改變應(yīng)構(gòu)成失血性休克死亡機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一。

可見，在失血性休克機(jī)體組織缺血缺氧的情況下，過(guò)度輸液所致的組織液稀釋可全方位地嚴(yán)重影響相關(guān)氨基酸、脂肪酸等物質(zhì)參與糖酵解和三羧酸循環(huán)產(chǎn)能代謝以及諸多重要機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的活性物產(chǎn)生代謝，進(jìn)而加重組織ATP缺乏和抑制抗休克反應(yīng)，促進(jìn)死亡。

因此，過(guò)度輸液不但不利于改善其微循環(huán)，還可導(dǎo)致組織液稀釋與失血性休克的組織缺血缺氧之間形成惡性循環(huán)，加重肝等生命重要器官組織代謝功能損害，構(gòu)成過(guò)度輸液及其救治失血性休克的死亡機(jī)制[18-20]。

常量輸液組的肝組織各類氨基酸、脂肪酸等物質(zhì)濃度明顯增高，證實(shí)了臨床常規(guī)救治失血性休克輸液規(guī)范的有效性。但是，在重度失血性休克機(jī)體有效循環(huán)血量減少、組織缺血缺氧情況下，常規(guī)輸液量如何調(diào)動(dòng)大量氨基酸、脂肪酸等抗休克的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增加肝組織的有效代謝濃度的機(jī)制，尚需深入研究。

對(duì)肝組織差異代謝物相對(duì)含量與失血性休克家兔死亡進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)琥珀酸含量與未輸液組和過(guò)度輸液組均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），可將其作為法醫(yī)學(xué)死亡原因鑒定中失血性休克及其死亡機(jī)制分析的代謝組學(xué)指標(biāo)之一[21]。

3.4 結(jié)論

不同輸液量救治失血性休克，死亡率明顯不同，常規(guī)輸液量可顯著增加氨基酸、脂肪酸等重要營(yíng)養(yǎng)代謝物和生物活性物質(zhì)的濃度，救治失血性休克療果顯著。重度失血性休克時(shí)過(guò)度輸液與未輸液救治的死亡率均很高且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。特別是過(guò)度輸液的致死相關(guān)因素是重要器官的組織液稀釋（或體液稀釋），即包括血液和組織液（包括細(xì)胞內(nèi)外液）的營(yíng)養(yǎng)代謝物和生物活性物質(zhì)的濃度顯著降低，與失血性休克微循環(huán)障礙的組織缺血缺氧形成惡性循環(huán)，促進(jìn)死亡，構(gòu)成了不容忽視的過(guò)度輸液死亡機(jī)制。肝組織琥珀酸含量明顯降低可作為鑒定失血性休克及其死亡的代謝指標(biāo)之一。