王 平 ，劉曉云 ，3，劉 遙 ，羅葉鋒 ，王 震

（1.廣州正孚檢測技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東正孚法醫(yī)毒物司法鑒定所，廣東 廣州510663；3.廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣東 廣州 510663）

卡西酮類毒品是近些年出現(xiàn)的新型毒品，在世界范圍內(nèi)已形成濫用趨勢，其母體結(jié)構(gòu)為卡西酮，主要包括甲卡西酮（methcathinone，MC）、4-甲基甲卡西酮（4-methyl methcathinone，mephedrone）和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮（3，4-methylenedioxy-N-methylcathinone，methylone）等?？ㄎ魍愇镔|(zhì)濫用會導(dǎo)致健康問題和毒品依賴，過量濫用易造成不可逆的永久性腦部損傷甚至死亡。目前，《精神藥品品種目錄（2013年版）》已將甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮、3，4-亞甲二氧基甲卡西酮收入管制目錄。近年來，卡西酮類毒品已在我國沿海地區(qū)及陜西、山西等地泛濫[1]，大劑量乙醇與甲卡西酮共同作用甚至可引起死亡的發(fā)生[2]。因此有必要建立方便、快捷、準(zhǔn)確的人體體內(nèi)檢材中卡西酮類毒品的定性定量檢測方法。目前尿液樣本中卡西酮類毒品的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[3-4]、液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[5-6]及固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法[7]等，4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮的檢測方法[8-9]較少。本研究擬建立尿液樣本中甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮的固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（solid phase extraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPE-GC-MS），用于卡西酮類毒品濫用者尿液中卡西酮類毒品的定性定量檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

甲卡西酮（1.0 mg/mL）、麻黃堿-d3（100 μg/mL）、4-甲基甲卡西酮（1.0 mg/mL）、4-甲基甲卡西酮-d3（100μg/mL）、3，4-亞甲二氧基甲卡西酮（1.0mg/mL）、3，4-亞甲二氧基甲卡西酮-d3（100 μg/mL）均購自美國Cerilliant公司，七氟丁酸酐（heptafluorobutyric anhydride，HFBA）購自美國Regis Technologies公司，色譜純甲醇與乙酸乙酯購自德國MERCK公司，分析純鹽酸、冰乙酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉購自廣州化學(xué)試劑廠，實驗用水為超純水，由Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制得。

48位正壓固相萃取儀（帶氮氣吹干功能）、固相萃取小柱（CLIN-Ⅱ，691-0353）購自美國SPEware公司，BZF-6020真空干燥箱購自上海索譜儀器有限公司，7890氣相色譜儀、5975質(zhì)譜檢測器購自美國Agilent公司。

1.2 樣本及前處理

本研究卡西酮類毒品濫用者尿液樣本由山西省長治市公安局提供。

取待檢尿液樣品100μL，加入0.9mL空白尿液樣品，加入磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）平衡。依次加入1mL甲醇、1mL去離子水、1mL磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）活化固相萃取柱。將平衡好的尿液樣品加入固相萃取柱，自然流干；依次用2mL去離子水、1mL 0.1mol/L鹽酸洗滌雜質(zhì)，氮氣吹干1 min；再加入2 mL甲醇洗滌雜質(zhì)，吹干5min。加入乙酸乙酯-氨水（體積比為98∶2）溶液2mL洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，氮氣37℃吹干。加入 25 μL 乙酸乙酯和 25 μL HFBA，混勻，轉(zhuǎn)入鉗口進樣瓶內(nèi)，鉗緊，65℃加熱衍生20 min。待GC/MS分析。

1.3 儀器條件

色譜柱為DB-5MS柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），購自美國Agilent公司。升溫程序：柱溫80℃保持1min；以50℃/min升至160℃，保持1min；以10℃/min升至180℃，保持3min；以80℃/min升至300℃，保持0.5 min。進樣口溫度190℃，接口溫度300℃。不分流進樣；載氣為氦氣，流速2.2 mL/min；進樣量2 μL；電子能量為70 eV。采用選擇離子監(jiān)測（selected ion monitor，SIM）模式進行定量分析。

1.4 方法學(xué)驗證

1.4.1 特異性

取9份不同來源的空白尿液樣品，其中2份為僅加入內(nèi)標(biāo)物的空白尿液樣品，1份添加10μg/mL其他毒（藥）物成分（嗎啡、冰毒、大麻、美沙酮、巴比妥等常見毒品及藥物），按1.2節(jié)進行前處理，按1.3節(jié)操作分析驗證方法的特異性。

1.4.2 檢出限、定量限和線性

取空白尿液，加入甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為0、1.0、2.0、3.0、5.0ng/mL的尿液樣品，加入內(nèi)標(biāo)物，按1.2節(jié)和1.3節(jié)方法進行前處理和分析。信噪比大于3時對應(yīng)的質(zhì)量濃度即為本方法檢出限，信噪比大于10對應(yīng)的質(zhì)量濃度即為本方法定量限[10]。

將甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白尿液中配制成質(zhì)量濃度為0、25、50、100、200 ng/mL 的樣品，再加入50 μL 1000ng/mL內(nèi)標(biāo)液按1.2節(jié)進行前處理，按1.3節(jié)進行分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），對應(yīng)質(zhì)量濃度的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)（y），繪制不強制過零點的一元線性方程，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。同時分5d做平行重復(fù)測試，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.4.3 精密度和準(zhǔn)確度

取空白尿液，配制成質(zhì)量濃度為50 ng/mL及150ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，每個質(zhì)量濃度配制6個樣品，連續(xù)5 d，根據(jù)檢測結(jié)果計算該方法的日內(nèi)、日間精密度[以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示]以及準(zhǔn)確度。

1.4.4 回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性

取空白尿液，按以下方法配制成質(zhì)量濃度為50 ng/mL和100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品：在固相萃取前加入標(biāo)準(zhǔn)溶液（測得峰面積為A）、經(jīng)固相萃取后添加標(biāo)準(zhǔn)溶液于洗脫液（測得峰面積為B）、不做處理直接添加標(biāo)準(zhǔn)溶液（測得峰面積為C）。分別檢測上述3種前處理條件下樣品的峰面積，按照下列公式計算樣品前處理的回收率以及基質(zhì)效應(yīng)：

另外，取空白尿液配制50 ng/mL和100 ng/mL兩個質(zhì)量濃度水平3個平行的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，按照1.2節(jié)方法對樣品進行前處理，分別在樣品處理當(dāng)天及室溫放置24 h后按1.3節(jié)方法進行定量分析，確定24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性。

2 結(jié)果和討論

2.1 特異性

空白尿液樣品在卡西酮類毒品衍生物出峰時間無干擾峰，方法的特異性較好。空白尿液及空白尿液中添加目標(biāo)物的總離子流圖見圖1～2?？ㄎ魍惗酒返谋Ａ魰r間及特征離子見表1。

圖1 空白尿液樣品的總離子流圖

圖2 空白尿液樣品添加卡西酮類毒品的總離子流圖

表1 卡西酮類化合物及內(nèi)標(biāo)物保留時間、特征離子及相對豐度

2.2 線性范圍、檢出限及定量限

尿液中甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）＞0.99，檢出限均為2.0 ng/mL，定量限均為25.0ng/mL。結(jié)果見表2。

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

本研究各待測物的準(zhǔn)確度為95.8%～107.7%，精密度為0.5%～5.7%，均滿足準(zhǔn)確度和精密度的要求。結(jié)果見表3。

2.4 回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性

本研究各待測物提取回收率為98.4%～105.7%，表明固相萃取的前處理方法可達到較好的萃取效果?；|(zhì)效應(yīng)均落在-5.4%～3.4%區(qū)間內(nèi)，固相萃取的方法對待測成分的抑制較低，給準(zhǔn)確定量提供了保障，內(nèi)標(biāo)法的回收率及基質(zhì)效應(yīng)均滿足要求。結(jié)果見表3。

50 ng/mL和100 ng/mL兩個質(zhì)量濃度3個平行的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，在24h后的測試值和當(dāng)天測試值相對誤差均小于5%。結(jié)果見表4。

表2 尿液樣品中3種卡西酮類毒品的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

表3 尿液樣品中3種卡西酮類毒品的精密度、準(zhǔn)確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng) （%）

表4 尿液樣品中卡西酮類毒品固相萃取穩(wěn)定性 （n=3，±s，ng·mL-1）

表4 尿液樣品中卡西酮類毒品固相萃取穩(wěn)定性 （n=3，±s，ng·mL-1）

測試時間/h 0 24甲卡西酮50ng·mL-1 55.7±1.5 54.3±1.1 100ng·mL-1 95.1±2.3 96.8±3.4 4-甲基甲卡西酮50ng·mL-1 50.1±0.6 49.7±0.5 100ng·mL-1 98.6±0.5 96.8±0.6 3，4-亞甲二氧基甲卡西酮50ng·mL-1 50.2±0.8 49.8±0.3 100ng·mL-1 99.1±0.6 99.0±0.4

2.5 案例應(yīng)用

收集1例疑似卡西酮類毒品濫用者的尿液樣品，按1.2節(jié)方法進行分析，在樣品中檢出甲卡西酮成分。采用內(nèi)標(biāo)法結(jié)合SIM模式進行定量分析，定量結(jié)果為1582.0ng/mL，SIM色譜圖見圖3。

圖3 甲卡西酮陽性樣品的SIM色譜圖

3 結(jié) 論

本研究采用SPE-GC-MS方法建立了人體尿液樣本中甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮的定性定量檢測方法，同位素內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物理化性質(zhì)接近，降低了目標(biāo)物在樣品前處理和儀器測定過程中產(chǎn)生的誤差，保證了定量的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。鑒于涉毒案例尿液中卡西酮類毒品的濃度范圍變化較大，高濃度陽性樣品可通過空白尿液稀釋來彌補線性范圍不足的缺點。

本研究建立的方法準(zhǔn)確、靈敏，可用于卡西酮類毒品濫用者尿液中卡西酮類毒品的定性定量檢測分析。