劉少丹，閔 濤，王 玫，張大明

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

在色譜-質(zhì)譜定性分析中，保留時間（retention time，RT）或相對保留時間（relative retention time，RRT）是定性結(jié)果判定的重要參數(shù)。不同應(yīng)用領(lǐng)域的管理部門或?qū)I(yè)組織因各自檢測目的不同，對不同檢測對象給出的化合物保留時間的規(guī)定（即目標(biāo)物的保留時間與對照品的保留時間之間的最大允許偏差）具有很大差異。國外多數(shù)應(yīng)用領(lǐng)域[1-8]關(guān)于GC-MS定性分析陽性結(jié)果中保留時間的規(guī)定，要求化合物RT的最大允許偏差為2%或±0.1 min。國內(nèi)各應(yīng)用領(lǐng)域有關(guān)生物樣品中藥物和農(nóng)藥殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范中，色譜保留時間的規(guī)定多為“待測物與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相同或一致”[9-13]；在公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中則認(rèn)為“生物檢材中出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰且空白無干擾”即可[14-15]。2010年之后，生物樣品中物質(zhì)的定性判定標(biāo)準(zhǔn)陸續(xù)與國際接軌，將RT的最大允許相對偏差設(shè)定為±2%[16-18]。但這個指標(biāo)能否真正滿足法醫(yī)毒物分析檢測的需要，有待進(jìn)一步商榷。特別值得關(guān)注的是，國內(nèi)現(xiàn)行有效的有關(guān)生物樣品中藥物和農(nóng)藥殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范中，部分還是在沿用“待測物與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相一致”的要求。本研究通過采用GC-MS的全掃描模式對敵敵畏、甲拌磷、地西泮和艾司唑侖4種常見毒（藥）物進(jìn)行檢測，以探討法醫(yī)毒物分析中GC-MS檢測血樣中常見毒（藥）物的保留時間與對照品之間的最大允許偏差，以期為法醫(yī)毒物分析中保留時間的判定指標(biāo)確定提供科學(xué)可靠的實驗數(shù)據(jù)，同時為其他領(lǐng)域中保留時間的規(guī)定提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

GCMS-TQ8030三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司），7890A-5875C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），3-30K高速冷凍離心機（德國Sigma公司），PL2002-IC電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，10-XC-88L醫(yī)用低溫箱（合肥市齊美電器有限公司）。

敵敵畏、甲拌磷、地西泮和艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)品（1 mg/mL）均購于中國計量科學(xué)研究院，磷酸三丁酯（99.8%）和鹽酸雙苯戊二氨酯（SKF525A，99.8%）均購于美國Sigma公司，甲醇、乙醇及乙酸乙酯為分析純。

1.2 GC-MS條件

GC-MS條件1和GC-MS條件2在實驗室1（Lab1）進(jìn)行，GC-MS條件3在實驗室2（Lab2）進(jìn)行。

1.2.1 GC-MS條件1

GCMS-TQ8030三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱為Rxi-5MS毛細(xì)管柱（30.0m×0.25mm，0.25μm）；柱溫：初始溫度100℃，保持1min，升溫速率為10℃/min，至280℃保持5min；載氣為He，流速為1mL/min；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1，進(jìn)樣體積為1μL。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子束能量70eV，離子源溫度250℃，接口溫度270℃，溶劑延遲時間為2min；掃描方式為全掃描，掃描范圍為m/z50～450。

1.2.2 GC-MS條件2

GCMS-TQ8030三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱（30.0 m×0.32 mm，0.25 μm）；柱溫：初始溫度80℃，保持2min，升溫速率為10℃/min，至280℃保持5 min；載氣為He，流速為1 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1，進(jìn)樣體積為1μL。

質(zhì)譜條件如1.2.1節(jié)所述質(zhì)譜條件。

1.2.3 GC-MS條件3

7890A-5875C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱（30.0m×0.25mm，0.25μm）；柱溫：初始溫度100℃，保持1min，升溫速率為10℃/min，至230℃保持5min；載氣為He，流速為1mL/min；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1，進(jìn)樣體積為1μL。

質(zhì)譜條件如1.2.1節(jié)所述質(zhì)譜條件。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL的甲拌磷和敵敵畏混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液A，用乙醇配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL的地西泮和艾司唑侖混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液B，分別置于-20℃冰箱冷凍保存。使用時按需稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

用乙醇配制質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的磷酸三丁酯、SKF525A內(nèi)標(biāo)儲備液，分別置于-20℃冰箱冷凍保存。使用時稀釋成10μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液A，逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5和10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個工作液中均含有2μg/mL的內(nèi)標(biāo)磷酸三丁酯。

分別取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液B，逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5和10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個工作液中均含有1μg/mL的內(nèi)標(biāo)SKF525A。

1.4 樣品前處理

樣品前處理程序：移取血液0.5mL，加1mL乙酸乙酯，超聲10 min混勻，-4℃下以10 397×g離心5 min，移取上清液600 μL，添加200 μL不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和200 μL內(nèi)標(biāo)工作液，搖勻后，取1 μL進(jìn)樣。甲拌磷和敵敵畏（內(nèi)標(biāo)為磷酸三丁酯）以Lab1的GC-MS條件1進(jìn)樣和Lab2的GC-MS條件3進(jìn)樣，地西泮和艾司唑侖（內(nèi)標(biāo)為SKF525A）以Lab1的GC-MS條件2進(jìn)樣。

抽取編號為1～20的20人份血樣，每份血樣分別按照上述前處理過程配制成質(zhì)量濃度為0、1、2、5μg/mL的甲拌磷和敵敵畏的混合加標(biāo)血樣，同一質(zhì)量濃度的加標(biāo)血樣在每份血樣中制備3個。抽取編號為21的血樣，按照上述前處理過程配制成質(zhì)量濃度為0、0.5、1、2、5、10μg/mL的甲拌磷和敵敵畏的混合加標(biāo)血樣，同一質(zhì)量濃度的加標(biāo)血樣制備11個。

抽取編號為1～20的20人份血樣，每份血樣分別按照上述前處理過程配制成質(zhì)量濃度為0、0.5、1、2、5、10μg/mL的甲拌磷和敵敵畏或地西泮和艾司唑侖的混合加標(biāo)血樣，同一質(zhì)量濃度的加標(biāo)血樣在每份血樣中制備6個。

根據(jù)預(yù)實驗，血樣添加甲拌磷和敵敵畏的檢出限（limit of detection，LOD，信噪比大于3）和2倍檢出限（2LOD）分別為0.05 μg/mL和0.1 μg/mL，血樣添加甲拌磷和敵敵畏的定量限（limit of quantitation，LOQ，信噪比大于10）和2倍定量限（2LOQ）分別為0.15μg/mL和0.3 μg/mL；血樣添加地西泮和艾司唑侖的LOD和2LOD分別為0.03μg/mL和0.06μg/mL，血樣添加地西泮和艾司唑侖的LOQ和2LOQ分別為0.1 μg/mL和0.2 μg/mL。配制相應(yīng)質(zhì)量濃度的血液添加樣品，每個質(zhì)量濃度制備12個，按照上述前處理方法進(jìn)行前處理。同時按照1.3節(jié)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，制備相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個質(zhì)量濃度制備12個。

1.5 進(jìn)樣順序

按照空白試劑、混合標(biāo)準(zhǔn)工作液、不同濃度加標(biāo)血樣的順序循環(huán)進(jìn)樣，進(jìn)樣過程中均按照0、0.5、1、2、5、10μg/mL的順序進(jìn)樣，在10μg/mL質(zhì)量濃度后添加洗針步驟。

1.6 數(shù)據(jù)處理

血液添加樣品RT的絕對偏差即血液添加樣品中的RT與標(biāo)準(zhǔn)對照品RT的差值；血液添加樣品RT的相對偏差是其絕對偏差與標(biāo)準(zhǔn)對照品RT的比值。血液添加樣品RRT的絕對偏差即血液添加樣品中的RRT與標(biāo)準(zhǔn)對照品RRT的差值；血液添加樣品RRT的相對偏差是其絕對偏差與標(biāo)準(zhǔn)對照品RRT的比值。

本實驗中可以忽略樣品制備、進(jìn)樣體積、儀器測量所帶來的B類不確定度，因此其合成不確定度（UC）可以視為A類不確定度（UA），UA（n）=SD×n1/2，其中SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差，n為樣品量。擴展不確定度（U）的公式為U=k×UC（n），其中k為包含因子，k=3（置信區(qū)間為99%）[19]。

兩個實驗室保留時間的偏差經(jīng)SPSS 20.0軟件的兩樣本t檢驗，發(fā)現(xiàn)兩個實驗室保留時間的偏差差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此分析數(shù)據(jù)時，將兩實驗室的數(shù)據(jù)合在一起處理。本實驗中將不符合要求的數(shù)據(jù)（信噪比小于3或因人為及儀器因素所致不正常的數(shù)據(jù)）剔除，血液添加樣品一共有2316個數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間的檢測結(jié)果

敵敵畏、甲拌磷和內(nèi)標(biāo)磷酸三丁酯的RT分別為 5.549 min、11.005 min和 10.349 min（圖1），地西泮、艾司唑侖和內(nèi)標(biāo)SKF525A的RT分別為19.079 min、22.673 min和17.981 min（圖2）。

圖1 0.5μg/mL敵敵畏、甲拌磷和磷酸三丁酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液GC-MS條件1總離子流色譜圖

表1～2表明，同一質(zhì)量濃度不同時間進(jìn)樣RT的標(biāo)準(zhǔn)差為0.001～0.015min，不同質(zhì)量濃度不同時間進(jìn)樣RT 的合成不確定度為2.6×10-4～11.3×10-4，擴展不確定度為7.8×10-4～33.9×10-4。4種毒（藥）物標(biāo)準(zhǔn)品RRT的標(biāo)準(zhǔn)差極小，最大的擴展不確定度為5.4×10-4。

表1 4種藥物標(biāo)準(zhǔn)品的RT值（Lab1） （±s，min）

表1 4種藥物標(biāo)準(zhǔn)品的RT值（Lab1） （±s，min）

注：“-”表示樣本數(shù)據(jù)不符合，已剔除；1）在同質(zhì)量濃度的12個樣本中，符合實驗要求的樣本量；UC（n）表示合成不確定度

質(zhì)量濃度/（μg·mL-1）LOD 2LOD LOQ 2LOQ 0.5 1.0 2.0 5.0 10.0合計敵敵畏RT 5.552±0.006 5.557±0.006 5.552±0.003 5.551±0.002 5.551±0.002 5.550±0.001 5.551±0.001 5.545±0.003 5.536±0.001 5.547±0.003 2.9×10-4樣本量12 12 12 12 12 12 12 12 12 108 108甲拌磷樣本量RT地西泮樣本量艾司唑侖樣本量--1 2--31）91）21）91）UC（n）12 12 12 12 12 12 84 84 10.999±0.003 10.998±0.001 11.004±0.001 11.004±0.001 11.005±0.001 11.001±0.003 10.993±0.001 11.001±0.005 5.5×10-4 12 12 12 12 12 12 12 96 96 RT 19.068±0.002 19.074±0.002 19.073±0.002 19.079±0.002 19.069±0.010 19.075±0.003 19.073±0.002 19.069±0.002 19.066±0.012 19.070±0.007 7.1×10-4 12 12 12 12 12 12 12 95 95 RT 22.692±0.011 22.681±0.007 22.672±0.003 22.679±0.004 22.671±0.004 22.661±0.011 22.666±0.002 22.662±0.002 22.659±0.015 22.664±0.011 11.3×10-4

表2 敵敵畏和甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)品的RT值（Lab2） （±s，min）

表2 敵敵畏和甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)品的RT值（Lab2） （±s，min）

注：UC（n）表示合成不確定度

質(zhì)量濃度/（μg·mL-1）0.5 1.0 2.0 5.0 10.0合計敵敵畏 甲拌磷RT 10.639±0.004 10.639±0.004 10.638±0.003 10.639±0.004 10.639±0.004 10.639±0.004 5.2×10-4 UC（n）樣本量12 12 12 12 12 60 60 RT 5.209±0.002 5.209±0.002 5.209±0.002 5.209±0.002 5.210±0.002 5.209±0.002 2.6×10-4樣本量12 12 12 12 12 60 60

2.2 血液添加樣品保留時間的檢測結(jié)果

分析血液添加樣品保留時間的檢測結(jié)果時，發(fā)現(xiàn)RT和RRT的擴展不確定度分別為6.0×10-4～14.1×10-3和2.5×10-6～5.9×10-5（k=3），可以認(rèn)為血液添加樣品保留時間在同一濃度和不同濃度均比較穩(wěn)定。

2.2.1 血液添加樣品RT的絕對偏差

血液添加樣品RT的絕對偏差中，95.42%（2 210/2316）的測試中目標(biāo)物RT的絕對偏差在±0.02min范圍內(nèi)，100%的絕對偏差在±0.03min范圍內(nèi)。圖3A是4種毒（藥）物RT的絕對偏差與RT的關(guān)系圖，發(fā)現(xiàn)RT的絕對偏差與RT本身的大小無明顯關(guān)系。

2.2.2 血液添加樣品RT的相對偏差

血液添加樣品RT的相對偏差中，97.41%（2 256/2 316）的測試中目標(biāo)物RT的相對偏差≤0.2%，100%的相對偏差≤0.4%。從圖3B可以看出，血液添加樣品RT的相對偏差隨著RT的增加有減小趨勢。

2.2.3 血液添加樣品RRT的絕對偏差

所有血液添加樣品RRT的絕對偏差在±0.003min范圍內(nèi)。從圖4A可以看出，血液添加樣品RRT的絕對偏差與RRT本身的大小無明顯關(guān)系。

2.2.4 血液添加樣品RRT的相對偏差

95.38%（2 209/2 316）血液添加樣品RRT的絕對偏差≤0.1%，100%的絕對偏差≤0.3%。從圖4B可以看出，血液添加樣品RRT的相對偏差與RRT本身的大小無明顯關(guān)系。

圖3 血液添加樣品RT的絕對偏差和相對偏差

圖4 血液添加樣品RRT的絕對偏差和相對偏差

3 討 論

3.1 RT的判定

通過分析RT的擴展不確定度發(fā)現(xiàn)，即使是LOD附近的RT也比較穩(wěn)定。因此可以認(rèn)為兩個實驗室敵敵畏、甲拌磷、地西泮和艾司唑侖對照品的RT均比較穩(wěn)定。

根據(jù)RT的偏差和趨勢，用血液添加樣品RT的相對偏差作為標(biāo)準(zhǔn)是不合理的。首先，如果采用相對偏差標(biāo)準(zhǔn)，即隨保留時間的增加，相對偏差應(yīng)該處于一個較穩(wěn)定的變化范圍，但是實驗結(jié)果表明，相對偏差隨保留時間的增加有減小趨勢。其次，如果采用相對偏差標(biāo)準(zhǔn)，表示隨保留時間的增加絕對偏差也在增加，但是實驗結(jié)果表明，隨保留時間的增加，絕對偏差相對獨立。第三，國內(nèi)司法鑒定技術(shù)規(guī)范[16-17]及公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[18]中，氣相色譜RT的相對偏差標(biāo)準(zhǔn)為±2%，即當(dāng)保留時間為1min時，相對偏差為±0.02min，當(dāng)保留時間為20min時，相對偏差為±0.4min，這明顯不符合實驗結(jié)果。因此RT的參考標(biāo)準(zhǔn)推薦采用絕對偏差標(biāo)準(zhǔn)。本實驗結(jié)果表明，RT的絕對偏差≤0.03min，而“指南”[2，4-5，20-22]中RT的絕對偏差判定為≤0.05～0.2min，因此，本研究認(rèn)為血液添加樣品RT絕對偏差的判定指標(biāo)選擇≤0.05min比較合理。

3.2 RRT的判定

通過對敵敵畏、甲拌磷、地西泮和艾司唑侖對照品RRT擴展不確定度的分析，發(fā)現(xiàn)RRT在同一濃度及不同濃度均比較穩(wěn)定。

美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)市場服務(wù)署（United States Department of Agriculture/Agricultural Marketing Service，USDA/AMS）發(fā)布的《農(nóng)藥數(shù)據(jù)程序》（Pesticide Data Program，PDP）[20]給出RRT的絕對偏差標(biāo)準(zhǔn)為±0.01min，與本實驗結(jié)果相比較，此標(biāo)準(zhǔn)過于寬松，判定范圍相差較大。因此不建議采用RRT的絕對偏差來設(shè)立判定指標(biāo)。在國際反興奮劑機構(gòu)（World Anti-Doping Organization，WADA）2010年發(fā)布的《色譜-質(zhì)譜法定性分析的判定標(biāo)準(zhǔn)》[4]和《殘留分析質(zhì)量控制指南》[23]中，設(shè)立RRT的相對參考標(biāo)準(zhǔn)分別為≤1%和≤0.5%，本實驗結(jié)果在±0.3%內(nèi)變化，符合其規(guī)定。因此，血液添加樣品RRT相對偏差的判定標(biāo)準(zhǔn)選擇±0.5%較為合理。

對于色譜保留時間的“待測物與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相同或一致”[9-13]及“生物檢材中出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰且空白無干擾”[14-15]的判定指標(biāo)不具備可操作性，而RT的最大允許相對偏差設(shè)定為≤2%[16-18]又顯得過于寬松，可能造成假陽性結(jié)果。本研究在血樣中添加敵敵畏、甲拌磷、地西泮和艾司唑侖，進(jìn)行多次測試，根據(jù)測試結(jié)果推薦RT的最大允許偏差為±0.05min，即3.0s，血液添加樣品RRT的最大允許偏差為±0.5%。需要指出的是，此結(jié)果系基于本實驗室所用儀器、測試條件及所涉目標(biāo)物得出。