楊 楊，張曉光，于 峰，施 妍，秦曉欣，苗鑫剛，董 玫，文 迪，馬春玲

（1.河北醫(yī)科大學法醫(yī)學院 河北省法醫(yī)學重點實驗室 河北省法醫(yī)分子鑒定協(xié)同創(chuàng)新中心 河北醫(yī)科大學法醫(yī)鑒定中心，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學醫(yī)學與健康研究院 大型儀器設備共享服務平臺，河北 石家莊 050017；3.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063；4.石家莊市公安局物證鑒定所，河北 石家莊 050000）

除草劑在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中應用廣泛，其生產(chǎn)量和使用量逐年增加。目前我國常見的除草劑包括季銨鹽、有機磷、酰胺、磺酰脲及三氮苯等10余種類型[1-5]。同時，由誤服、投毒、自殺等引起的中毒案件也隨之增多[6]，對血液中除草劑進行快速準確的定性篩選和定量分析對相關案件的偵破及臨床中毒患者的診治意義重大[7-8]。目前生物檢材中除草劑的檢測方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細管電泳法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和免疫分析法[9-12]等。由于除草劑種類繁多、性質(zhì)多樣，故樣品前處理和儀器分析方法不一，現(xiàn)有文獻報道的方法多僅適用于性質(zhì)類似的除草劑篩選[13-15]。

本研究選取5類10種常見除草劑，基于蛋白沉淀前處理方法及超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法（ultrahigh performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，UPLC-HRMS）聯(lián)用分析，以建立一種穩(wěn)定、快速、靈敏的定性定量分析方法，并將其應用于實際案例。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

百草枯、敵草快、草甘膦、草銨膦、氰草津、莠去津、吡草胺、乙草胺、氯磺隆、甲磺隆標準品（1mg/mL的水或甲醇標準溶液）均購自上海市農(nóng)藥研究所有限公司，乙腈、甲醇（色譜純）購自美國Thermo Fisher Scientific公司，甲酸（色譜純）、乙酸銨（色譜純）均購自北京DiKMA公司，實驗用水均為Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備的超純水。

Q ExactiveTMFocus組合型四極桿OrbitrapTM質(zhì)譜儀、UltiMateTM3000高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific公司），高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），旋渦振蕩器（美國Corning公司），KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 溶液配制

混合標準物質(zhì)儲備液：分別精確吸取10 μL 1mg/mL的百草枯、敵草快、草甘膦、草銨膦、氰草津、莠去津、吡草胺、乙草胺、氯磺隆、甲磺隆標準物質(zhì)于容量瓶中用甲醇定容至10mL，得到質(zhì)量濃度為1μg/mL的混合標準物質(zhì)儲備液，儲存于4℃冰箱中。

混合標準物質(zhì)工作液：取1μg/mL混合標準物質(zhì)儲備液，用流動相逐級稀釋后配制成質(zhì)量濃度分別為500、100、50、20、10、5、1和0.5ng/mL的混合標準物質(zhì)工作液。

1.3 樣品前處理

取血液樣品200μL，加入乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=3∶1] 800 μL，充分混勻并渦旋 1 min，超聲5min后，在4℃下以離心半徑8.5cm，12000r/min，離心10 min，取上清液經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，待UPLCHRMS分析。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

Hypersil GOLDTMC18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），HyperREZ XP保護柱（3.0 mm×5.0 mm，1.9μm），均購自美國Thermo Scientific公司。柱溫為室溫。流動相A：0.1%甲酸溶液；流動相B：甲醇。梯度洗脫條件：0～6.5min，95%A；6.5～10.5min，5%A；10.5～12min，95%A。流速為0.3mL/min，進樣量為1μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源；電噴霧電壓為3 200 V；毛細管溫度為320℃；輔助加熱器溫度為300℃；鞘氣和輔助氣為氮氣（流速分別為30L/min、15L/min）；數(shù)據(jù)掃描方式為正負切換的全掃描/實時二級質(zhì)譜掃描（Full MS/dd-MS2）模式，一級全掃描（m/z50～750）分辨率為70000，二級掃描（dd-MS2）分辨率為17500。通過連續(xù)注射分析質(zhì)量濃度為1μg/mL的除草劑標準品，獲得各目標物的一級和二級離子，相關UPLC-HRMS參數(shù)見表1。

表1 10種除草劑的UPLC-HRMS參數(shù)

1.5 方法學驗證

對所建立的方法進行方法學驗證，包括線性、檢出限、定量限、準確度、精密度、提取回收率和基質(zhì)效應。

線性、檢出限和定量限：取空白血液樣品，添加10種除草劑混合標準物質(zhì)溶液，配制成質(zhì)量濃度為500、100、50、20、10、5、1和0.5 ng/mL的加標樣品，按照1.3節(jié)方法進行樣品前處理，以每個目標物質(zhì)量濃度為橫坐標（x），以提取的一級定量離子峰面積為縱坐標（y），用加權最小二乘法進行回歸運算，求得線性方程，以信噪比≥3時對應的標準物質(zhì)質(zhì)量濃度為檢出限，信噪比≥10時對應的標準物質(zhì)質(zhì)量濃度為定量限。

準確度、精密度和提取回收率：選取空白血樣，分別精確添加不同質(zhì)量濃度的10種除草劑混合標準物質(zhì)溶液，配制成低濃度（1倍定量限）、中濃度（2倍定量限）、高濃度（10倍定量限）3個濃度水平的質(zhì)量控制樣品，每個濃度水平平行測定6份，按1.3節(jié)的方法處理后，在1.4節(jié)的色譜和質(zhì)譜條件下進行檢測，連續(xù)檢測3 d，計算方法的準確度、日內(nèi)精密度、日間精密度；空白加標血樣峰面積帶入擬合標準曲線中計算回收率。

基質(zhì)效應：由于血液樣品基質(zhì)較為復雜，分析物以外的成分會對分析物質(zhì)有一定的干擾，從而影響分析結果的準確性[16]。為評價本方法的基質(zhì)效應，首先按1.2節(jié)的方法配制10種除草劑的混合標準物質(zhì)溶液，得到各物質(zhì)擬合的線性回歸方程斜率，記為k0，取一定量的空白樣品，按照1.3節(jié)的樣品前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液配制10種除草劑的混合標準物質(zhì)溶液，測定得到各物質(zhì)擬合的線性回歸方程斜率記為k，基質(zhì)效應（M）通過公式M=k/k0-1進行計算[16-17]。

2 結 果

2.1 前處理方法的選擇

目標物萃取是分析方法中至關重要的步驟。由于除草劑種類繁多、性質(zhì)多樣，常規(guī)樣品預處理方法（如液-液萃取和固相萃?。┹^難滿足同時對多種類型除草劑進行篩選和定量檢測的需求。本研究選擇用蛋白沉淀法對血樣進行前處理，雖然方法檢出限與液-液萃取和固相萃取法相比較高，但操作簡便、成本低，尤其是可同時提取血液中10種除草劑，以備后續(xù)的UPLC-HRMS篩選分析。

乙腈與不同比例的水混溶后，其極性更有利于提取多種化合物。此外，當樣品溶劑與流動相的洗脫強度有差異，尤其是前者洗脫強度較強時，就會產(chǎn)生峰形和柱效的降低?；诖耍覀冊陬A實驗中分別用純乙腈、乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=1∶1]、乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=2∶1]、乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=3∶1]對空白加標樣品進行處理，結果發(fā)現(xiàn)在樣品中加入乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=3∶1]做沉淀劑時，蛋白沉淀效果良好，且色譜峰形最優(yōu)，目標物回收率最高。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先使用蠕動針泵以10μL/mL的流速將10種化合物直接注入質(zhì)譜儀中，確定每種除草劑的一級質(zhì)譜離子和二級質(zhì)譜離子的精確質(zhì)量數(shù)，然后連接液相部分，對質(zhì)譜離子源的參數(shù)進行優(yōu)化，在一定范圍內(nèi)（15～50 L/min）改變鞘氣和輔助氣的流量，通過觀察10種化合物的出峰情況，選擇最佳參數(shù)。當鞘氣和輔助氣的流速分別為30L/min和15L/min時，質(zhì)譜離子化效應最強，靈敏度最高。比較了不同分辨率（35000、70 000、100 000）下一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖的出峰情況，發(fā)現(xiàn)使用100000分辨率進行掃描得到的質(zhì)譜峰面積最小，靈敏度下降。而設置成35000分辨率時目標物質(zhì)出峰面積變大，儀器噪聲變大，檢出限降低。綜合考慮，將一級全掃描分辨率設置為70 000，其他質(zhì)譜參數(shù)經(jīng)系統(tǒng)軟件自動優(yōu)化。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

本實驗分別使用了10 mmol乙酸銨水溶液-乙腈、10 mmol乙酸銨水溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇3種流動相體系，按照1.4節(jié)的梯度洗脫程序，以100ng/mL的混合標準物質(zhì)進樣，通過比較10種化合物的出峰情況選擇最優(yōu)的流動相體系。結果以0.1%甲酸溶液-甲醇作為流動相時，10種化合物的出峰情況良好，峰形窄且對稱，與使用10 mmol乙酸銨水溶液-乙腈、10mmol乙酸銨水溶液-甲醇作流動相相比，靈敏度更高。這可能與本研究中大部分目標物母離子均是正離子模式出峰，流動相中加入甲酸比加入乙酸銨更能增大其離子化效應有關。因此，本方法選擇0.1%甲酸溶液-甲醇作為流動相。

2.4 方法學驗證

百草枯、敵草快、草甘膦、草銨膦、氰草津、莠去津、吡草胺、乙草胺、氯磺隆、甲磺隆的保留時間分別為 1.84、2.30、2.19、2.31、5.65、6.16、6.46、7.37、5.17、5.07min，其提取離子色譜圖見圖1。上述除草劑在各自線性范圍內(nèi)線性關系均良好，決定系數(shù)（R2）均大于0.993，測定值的相對標準偏差為1.5%～10.8%，日內(nèi)精密度為2.7%～13.5%，日間精密度為3.3%～13.3%，平均回收率為67.4%～111.9%，準確度為85.1%～106.1%。10種化合物的線性方程、檢出限見表2，回收率、準確度和精密度見表3。

圖1 10種化合物的提取離子色譜圖

表2 10種化合物的線性方程、檢出限和定量限

表3 10種化合物的回收率、準確度和精密度 （%）

續(xù)表3

如表2所示，草甘膦、氯磺隆等7種物質(zhì)的基質(zhì)效應在±0.20之間，但百草枯、敵草快、莠去津的基質(zhì)效應較大。因此，在實際案例應用中，一定要在同種基質(zhì)中進行加標回收以消除基質(zhì)效應的影響。

2.5 案例應用

將本研究所建方法于2018年1月—2018年5月在河北醫(yī)科大學法醫(yī)鑒定中心實際案例中進行應用，對10名可疑除草劑中毒者血液中的除草劑成分進行定性定量分析，其中6名為女性，4名為男性，年齡16～47歲，均為口服自殺。結果檢出百草枯中毒7例（0.09～78.48μg/mL）、草甘膦中毒1例（0.79μg/mL）、莠去津中毒1例（4.73 ng/mL）、乙草胺中毒1例（10.57 ng/mL）。上述案例中，7例百草枯中毒者均死亡，死者血液中百草枯質(zhì)量濃度均在致死血質(zhì)量濃度（0.05μg/mL[18]）以上，其余3例除草劑中毒者經(jīng)臨床搶救治療均存活。

3 結 論

本研究建立了血液中常見除草劑的篩查方法，以乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=3∶1]為蛋白沉淀劑對血樣進行處理后，采用UPLC-HRMS法進行檢測。本方法穩(wěn)定、快速、靈敏、準確度高，可同時對血液中多種類型除草劑進行快速準確的定性篩查和定量分析，對相關案件的偵破及臨床中毒患者的診治具有重要意義。