任攀，劉情，李文文，劉亞剛

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

鴨病毒性腸炎（DVE）又名鴨瘟，鴨瘟病毒（DPV）是該病的病原，屬于皰疹病毒科（為雙股DNA），具有皰疹病毒的基本特征[1]。胸苷激酶（TK）基因是大部分皰疹病毒復(fù)制的非必需基因，是皰疹病毒的主要毒力基因之一。研究表明，TK基因具有皰疹病毒早期基因的典型特征[2]，其編碼的胸苷激酶在胸腺嘧啶合成補(bǔ)救途徑中是必不可少的。皰疹病毒TK基因缺失后表現(xiàn)出在神經(jīng)細(xì)胞的復(fù)制能力明顯減弱，但其免疫原性不變，因而TK基因是皰疹病毒構(gòu)建缺失疫苗的首選靶基因[3]。本研究通過對鴨瘟病毒強(qiáng)、弱毒株TK基因的克隆與生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步明確DPV TK基因的功能提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株和質(zhì)粒 DPV AV 1221株購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，DPV雞胚化弱毒疫苗株購于廣西麗原生物股份有限公司，PMD-19T Vector購于天根生化科技有限公司。

1.2 主要試劑 DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞JM109均購于天根生化科技有限公司，Phusion High-Fidelity PCR Kit購于 New England Biolabs公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上收錄的DPV基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計出特異性引物（由擎科生物公司合成），用于DPV TK基因的擴(kuò)增。引物序列F1為5′-CGCGGATCCTCAC TGCGCGACTCTTGCGA，R1 為 5′-CCCAAGCTTATTA ATTGTCATCTCGGTAT。

1.4 病毒DNA提取 按照酚-氯仿-異戊醇法提取DNA，提取的DPV DNA置于-20℃保存。

1.5 TK基因的PCR擴(kuò)增 以提取的DNA為模板，根據(jù)設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：DNA 模板 2.5 μL，1μM 上下游引物各 2.5μL，5×Phusion Buffer 10 μL，10 μM dNTPs 1 μL，Phusion DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O 31 μL。PCR 反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性 30 s；95℃變性 10 s，55℃退火 30 s，72℃延伸35s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸8 min，16℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.6 TK基因的克隆及鑒定 將回收TK基因的PCR產(chǎn)物與載體PMD-19T連接，構(gòu)建重組克隆載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM 109，再接種于含X-gal、Amp（50mg/μL）和 IPTG 的平板上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落接種于含Amp（50 mg/μL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)大培養(yǎng)。菌液PCR鑒定：根據(jù)質(zhì)粒小提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。

1.7 TK基因的序列測定及生物信息學(xué)分析 將陽性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，同時對TK基因的核苷酸序列及其所推測氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.8 TK基因序列的相似性分析 對本次所測的2株鴨瘟病毒TK基因序列進(jìn)行BLAST分析，然后從GeneBank上下載鴨瘟病毒不同分離株的TK基因序列，然后通過Megalign程序進(jìn)行相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPV強(qiáng)、弱毒株TK基因擴(kuò)增 結(jié)果見圖1。圖中在約1077bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小符合，說明擴(kuò)增成功。

圖1DPV的PCR檢測結(jié)果

2.2 DPV TK基因重組質(zhì)粒鑒定 經(jīng)PCR驗證為陽性的重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，在約1077bp及2651bp位置處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2），表明重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 DPV TK基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 DPV強(qiáng)、弱毒株TK基因同源性分析 將測序得到的兩組序列用BioXM軟件進(jìn)行對比分析，得出兩片段的同源性高達(dá)100%。

2.3.2 胸苷激酶理化性質(zhì)分析 預(yù)測胸苷激酶由358個氨基酸組成，理論等電點(diǎn)pI為6.03。

2.3.3 蛋白親水性分析 胸苷激酶的疏水性分析結(jié)果顯示：胸苷激酶為親水性蛋白，但該蛋白N端（158～162aa）有一明顯的高疏水區(qū)域。

圖2 TK基因重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

2.3.4 DPV胸苷激酶的二級結(jié)構(gòu)及跨膜分析 分析結(jié)果顯示，胸苷激酶中α螺旋占50.28%，延伸鏈占11.45%，無規(guī)則卷曲占38.27%。根據(jù)Burhard理論推斷出該蛋白屬于混合型蛋白。胸苷激酶的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果顯示，胸苷激酶的全部氨基酸均位于細(xì)胞膜外部。

2.3.5 信號肽預(yù)測 胸苷激酶的信號肽預(yù)測顯示，氨基酸的信號肽分值（S-score）均低于閾值，可以判定胸苷激酶中沒有信號肽成分，不是分泌蛋白。

2.3.6 DPV胸苷激酶的抗原表位和B淋巴細(xì)胞抗原結(jié)合表位分析 抗原表位分析結(jié)果顯示，胸苷激酶的平均抗原趨向性為1.0277，共包含有14個可能的抗原表位，其中第11位至第30位氨基酸形成的抗原表位“IRRAFSVPSMPLCLVRVYLD”具有最高的抗原指數(shù)。使用Bcepred在線工具預(yù)測胸苷激酶的B淋巴細(xì)胞抗原結(jié)合表位，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)7個B細(xì)胞結(jié)合表位，見圖3。

圖3 DPV胸苷激酶的B細(xì)胞表位預(yù)測

2.3.7 TK基因序列的相似性分析 本研究中2株鴨瘟病毒的TK基因之間的相似性為100%，與GeneBank上TK基因序列的最高相似性為99.8%～100%。

3 小結(jié)與分析

本研究對DPV強(qiáng)、弱毒株的TK基因進(jìn)行了克隆、測序，得出兩片段的同源性高達(dá)100%，通過與其他不同來源的鴨瘟病毒株進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其同源性也達(dá)到了99.8%～100%，說明TK基因具有高度保守性。而樊振華等[4]、Kit等[5]敲除病毒的TK基因，可使毒株毒力下降，說明TK基因?qū)Σ《径玖Φ挠绊懞艽?。鴨瘟病毒TK基因的高度保守性，意味著利用TK蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法難以用來區(qū)分野毒感染與疫苗感染，并且TK基因不是導(dǎo)致鴨瘟強(qiáng)、弱毒株致病性差異的主要因素[6]。

生物信息學(xué)是生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最為快速的學(xué)科，具有高效、可預(yù)見性和綜合性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[7]。本試驗通過對TK蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示：TK蛋白為親水性，但其中所含高疏水性區(qū)域的氨基酸主要用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，猜測與胸苷激酶活性有關(guān)[8]；通過Burhard理論推斷TK蛋白的二級結(jié)構(gòu)，認(rèn)為該蛋白屬于混合型蛋白；跨膜區(qū)預(yù)測表明，DPV TK蛋白是膜外蛋白，說明TK蛋白不介導(dǎo)DPV對宿主細(xì)胞的吸附和轉(zhuǎn)染，同時也從側(cè)面證明了TK基因是DPV復(fù)制的非必需基因；信號肽預(yù)測得出該蛋白沒有信號肽成分，不是分泌蛋白；抗原表位分析顯示，TK蛋白具有最高的抗原指數(shù)；使用Bcepred在線工具預(yù)測胸苷激酶的B淋巴細(xì)胞抗原結(jié)合表位，共發(fā)現(xiàn)7個B細(xì)胞結(jié)合表位，表明TK蛋白擁有較高的抗原性。

本研究通過預(yù)測TK蛋白的性質(zhì)和功能，為蛋白的表達(dá)及抗原性鑒定提供了理論支持。

[1]Plummer P J，Alefantis T，Kaplan S，et al.Detection of duck enteritis virus by polymerase chain reaction[J].Avian Disease，1998，42（3）：554-564.

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[3]葛菡，程安春，汪銘書，等.皰疹病毒TK基因的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38（1）：86-90.

[4]樊振華，孟帆，吳忻，等.豬偽狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（4）：12-17.

[5]Kit S.Thymidine kinase[J].Microbiological Science，1985，12（2）：369-375.

[6]李昌主，韓先杰，鄒玲，等.鴨瘟病毒AV 1221 TK基因的克隆與序列分析[J].青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，24（3）：162-164.

[7]宋得華，潘華奇，黎應(yīng)勝，等.鴨瘟病毒TK基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（31）：9935-9936.

[8]葛菡，徐超，程安春，等.鴨瘟病毒TK基因的克隆及其分子特性分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38（4）：297-302.