孫承文，李 杰，賴迎迢，江小燕，黃志斌，陶家發(fā)*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380；2.中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

鰻弧菌(Vibrioanguillarum)是一種革蘭陰性、能動性海洋細菌，是引起魚類、甲殼類及貝類弧菌病的主要病原菌之一；海水魚類發(fā)病的主要特征為全身性出血性敗血癥。該病流行區(qū)域廣泛，危害嚴重，給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[1-3]。目前生產(chǎn)中防控鰻弧菌的主要方法仍是使用見效快、療效好的抗菌素類藥物。但隨著抗菌素的大量使用，病原弧菌的耐藥性特別是多重耐藥性日益嚴重，出現(xiàn)了大量的耐藥菌株。隨著對抗菌素等藥物使用安全性的日益重視，人們的認識已從“靶動物安全”提升到”人類食品安全”和“環(huán)境安全”[4]。開發(fā)預防水產(chǎn)病害的相關(guān)鰻弧菌疫苗，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和水產(chǎn)品安全具有十分重要的意義，已有多家科研單位研發(fā)了鰻弧菌疫苗，實驗室研究對海水魚類有良好的免疫效果。目前該疫苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)研究及應(yīng)用未見報道，本研究通過對鰻弧菌滅活疫苗原液規(guī)?；l(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，為更好培養(yǎng)鰻弧菌菌液，制備鰻弧菌全菌滅活疫苗及疫苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大菱鲆鰻弧菌菌株VAM003株由黃海水產(chǎn)研究所莫照蘭研究員提供，分離自山東省榮成市某養(yǎng)殖場發(fā)病魚肝臟。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨17，大豆蛋白胨 3，葡萄糖 2.5，磷酸氫二鉀 2.5，氯化鈉 25，pH 7.2～7.5，加入15 g/L瓊脂，為固體TSA；②LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，氯化鈉 25，培養(yǎng)基原料均購自試劑公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 恒溫搖床(上海智誠分析儀器制造有限公司ZWY-211B)、5 L自動發(fā)酵罐(日本Bioneer-N 5 L MDL-8c)、紫外分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司UV1800PC)、50～500 L自動發(fā)酵罐(福州福爾流體設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備 將凍干鰻弧菌的VAM003菌種用含2.5%NaCl的TSB液體培養(yǎng)基溶解后，劃線接種于含2.5% NaCl的TSA平板，28 ℃培養(yǎng)18～22 h，挑取典型菌落接種于含2.5% NaCl的TSB液體培養(yǎng)基，28 ℃震蕩培養(yǎng)12～14 h，作為一級種子液。

1.2.2 二級種子液培養(yǎng)時間的確定 將一級種子液按培養(yǎng)基總量的10%接種三角瓶，28 ℃、180 r/min 恒溫培養(yǎng)，每2 h取樣1次，測定OD600值，直到菌液OD600值不再增長，并繪制生長曲線。

1.2.3 不同鹽度對制苗菌液濃度的影響 將菌株VAM003種子液分別接種于含1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5% NaCl 的TSB培養(yǎng)基，以培養(yǎng)基總量的10%接種種子液，28 ℃，180 r/min 恒溫培養(yǎng)10 h，收獲菌液，進行活菌計數(shù)。

1.2.4 不同培養(yǎng)基對制苗菌液濃度的影響 將菌株VAM003種子液分別接種于300 mL含2.5% NaCl的TSB、LB培養(yǎng)中，28 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)10 h，收獲菌液，進行活菌計數(shù)，比較兩種培養(yǎng)基對培養(yǎng)菌液濃度的影響。

1.2.5 不同接種量對制苗菌液濃度的影響 將菌株VAM003種子液分別按5%、10%、15%的接種量接種5 L發(fā)酵罐(含2.5% NaCl的TSB培養(yǎng)基3 L)，28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)10 h，收獲菌液，進行活菌計數(shù)。

1.2.6 補料對發(fā)酵制苗菌液濃度的影響 配制2罐5 L發(fā)酵罐(含2.5% NaCl的TSB培養(yǎng)基3 L)，其中一罐另配制20%葡萄糖、10倍濃縮TSB各 200 mL作為補料進行補料發(fā)酵；按培養(yǎng)基總量的10%接種量發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 ℃，通氣攪拌培養(yǎng)。補料發(fā)酵時，發(fā)酵4 h后開始勻速添加補料葡萄糖，5 h后開始勻速添加補料10倍濃縮TSB。每2 h取樣1次，測定OD600值，直到菌液OD600值不再增長，并繪制生長曲線，取樣，平板計數(shù)測定菌液活菌數(shù)。

1.2.7 菌株VAM003500 L發(fā)酵罐放大發(fā)酵 按照1.2.6方法進行500 L發(fā)酵罐放大發(fā)酵驗證試驗。配制300 L含2.5% NaCl的TSB液體發(fā)酵培養(yǎng)基(其中種子罐30 L，發(fā)酵罐270 L)，同時按培養(yǎng)基容量的0.02%加入消泡劑，121 ℃高壓滅菌20 min；另配制20%葡萄糖、10倍濃縮TSB各 20 L作為補料；按培養(yǎng)基總量的10%接種二級種子液到50 L種子罐，28 ℃培養(yǎng)12 h，通風攪拌培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測定OD600值，平板計數(shù)測定菌液活菌數(shù)。種子罐培養(yǎng)結(jié)束接種到500 L發(fā)酵罐，28 ℃，通風攪拌培養(yǎng)，發(fā)酵4 h后開始勻速添加補料葡萄糖，5 h后開始勻速添加補料10倍濃縮TSB。每隔 2 h取樣，同上測定菌液OD600值，直到菌液OD600值不再增長，取樣，平板計數(shù)測定菌液活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 二級種子液培養(yǎng)時間的確定

二級種子液培養(yǎng)12 h后，OD600值到達高峰，菌液濁度最大，14 h后OD600值下降，表明菌株VAM003三角瓶培養(yǎng)時間不超過14 h。作為種子液培養(yǎng)以12～14 h為佳，結(jié)果見圖1。

2.2 鹽度對制苗菌液濃度的影響

培養(yǎng)10 h活菌計數(shù)結(jié)果表明，隨著鹽度的增加，活菌量也增加，在含2.5% NaCl的TSB培養(yǎng)基活菌數(shù)最高，活菌數(shù)為1.23×109cfu/mL；隨著鹽度繼續(xù)增加，在含3.0%、3.5%NaCl的TSB培養(yǎng)基活菌量減少。因此選擇含2.5% NaCl的鹽度作為菌株VAM003發(fā)酵培養(yǎng)基鹽度，結(jié)果見圖2。

圖1 菌株VAM003二級種子液生長曲線Fig.1 Culture oscillated growth curve of Vibrioanguillarum VAM003 strain

圖2 鹽度對菌株VAM003生長結(jié)果的影響Fig.2 Effects of diffent culture salinity on the growth of Vibrio anguillarum VAM003 strain

2.3 培養(yǎng)基對制苗菌液濃度的影響

培養(yǎng)10 h后活菌計數(shù)結(jié)果表明，以TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株VAM003菌液濃度更高，活菌數(shù)為1.21×109cfu/mL，表明TSB培養(yǎng)基更適合作為發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果見圖3。

2.4 接種量對制苗菌液濃度的影響

隨著二級種子接種量的增加，活菌數(shù)也增高，培養(yǎng)基接種10%～15%種子液，可以獲得較好的接種效果，活菌數(shù)達到5×109cfu/mL以上。同時試驗結(jié)果也表明，培養(yǎng)基接種10%～15%種子液其最終菌液濃度結(jié)果差異不明顯，因此從成本及培養(yǎng)效果因素考慮，選擇10%的接種量為適宜接種量，結(jié)果見圖4。

圖3 培養(yǎng)基對菌株VAM003生長結(jié)果的影響Fig.3 Effects of diffent culture medium on the growth of Vibrio anguillarum VAM003 strain

圖4 接種量對菌株VAM003生長結(jié)果的影響Fig.4 Effects of diffent inoculum size on the growth of Vibrio anguillarum VAM003 strain

2.5 補料對發(fā)酵制苗菌液濃度的影響

菌株VAM003發(fā)酵罐培養(yǎng)液在8 h內(nèi)生長較快，之后生長減慢，12 h左右達到生長最大值，隨后菌液濃度降低。而通過發(fā)酵培養(yǎng)過程添加補料培養(yǎng)基使得菌株VAM003發(fā)酵培養(yǎng)OD600值增加1.5倍以上，活菌數(shù)增加160%，結(jié)果見圖5、表1。

圖5 菌株VAM003在5 L發(fā)酵罐的生長結(jié)果Fig.5 Ferment growth curve of Vibrio anguillarum VAM003 strain in 5 L fermenter

表1 菌株VAM003在5 L發(fā)酵罐補料發(fā)酵活菌結(jié)果Table 1 Result of feeding fermentation of Vibrio anguillarum VAM003 strain in 5 L fermenter

2.6 菌株VAM003 500 L發(fā)酵罐放大發(fā)酵

50 L種子罐發(fā)酵培養(yǎng)10 h后進入穩(wěn)定生長期，培養(yǎng)12 h左右達到最高值。轉(zhuǎn)入500 L發(fā)酵罐補料培養(yǎng)8 h進人穩(wěn)定生長期，培養(yǎng)10 h左右鰻弧菌生長達到最大值(圖6、圖7)。補料培養(yǎng)活菌數(shù)可達1.20×1010cfu/mL，活菌數(shù)增加120%以上，結(jié)果表明補料培養(yǎng)能顯著提高大菱鲆鰻弧菌發(fā)酵菌液的濃度，結(jié)果見表2。

圖6 菌株VAM003在50 L種子罐的生長曲線Fig.6 Ferment growth curve of Vibrio anguillarum VAM003 strain in 50 L fermenter

圖7 菌株VAM003在500 L發(fā)酵罐的生長曲線Fig.7 Ferment growth curve of Vibrio anguillarum VAM003 strain in 500 L fermenter

表2 菌株VAM003 50～500 L發(fā)酵罐發(fā)酵活菌結(jié)果Table 2 Results of feeding fermentation of Vibrio anguillarum VAM003 strain in 50 L and 500 L fermenter

3 討 論

有學者研究報道了鰻弧菌疫苗接種雜交鱘[4]、大菱鲆[5-7]及牙鲆[8]等的免疫效果研究，目前該疫苗研制處于實驗室階段，尚未進入商品化疫苗生產(chǎn)。很多學者對鰻弧菌的培養(yǎng)條件進行了研究報道，鰻弧菌適宜生長的培養(yǎng)基包括Zobell 2216E、TSB、LB等，培養(yǎng)溫度在28～37 ℃，適宜鹽度4%以下[9-10]，對發(fā)酵罐規(guī)模化培養(yǎng)鰻弧菌較少報道。由于Zobell 2216E培養(yǎng)基配方含有陳海水組分，陳海水易對發(fā)酵罐不銹鋼罐體造成腐蝕，因而不適合作為規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)基。影響發(fā)酵的因素很多，如發(fā)酵菌種種類、培養(yǎng)基基質(zhì)、基質(zhì)配比、發(fā)酵時間、接種方式、pH、溫度等。陶家發(fā)等[11]通過對種子液量、pH、泡敵等條件優(yōu)化構(gòu)建了哈維氏弧菌、溶藻弧菌發(fā)酵工藝；商偉偉等[12]通過對4種假單胞菌產(chǎn)膿菌素培養(yǎng)基進行篩選，使其膿菌素產(chǎn)量最高可達到265 mg/dm3，約是基礎(chǔ)培養(yǎng)基產(chǎn)量的7倍以上；梁永增等[13]通過對溫度、pH 值、接種量、碳源、氮源、無機鹽對魚類水霉病原真菌拮抗菌菌株生長的優(yōu)化，使該菌株發(fā)酵培養(yǎng)達到對數(shù)生長末期的時間縮短了2 h ，能較快進入菌體密度最大的時期。劉潤澤等[14]通過對1株合成聚-β-羥基脂肪酸酯嗜鹽菌發(fā)酵碳氮比、溫度、pH值、轉(zhuǎn)速及裝液量等條件因子進行優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件，PHB產(chǎn)量達到峰值,為5.88 g/L。分批補料技術(shù)通過控制培養(yǎng)過程基質(zhì)濃度，解除細胞生長底物抑制，實現(xiàn)菌株的高密度生長與目標酶的高表達，已成為微生物發(fā)酵工藝研究和工業(yè)化應(yīng)用的重要策略[15-16]，馬紅葉等[17]構(gòu)建了重組大腸埃希菌產(chǎn)疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶分批補料發(fā)酵工藝，文瑤等[18]通過補料發(fā)酵方法使乳酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了21.1%和21.2%，發(fā)酵周期縮短了一半。

本研究通過對鹽度、培養(yǎng)基、接種量的優(yōu)化，利用發(fā)酵罐補料發(fā)酵工藝，在5 L發(fā)酵罐可以獲得1.37×1010cfu/mL活菌數(shù)。鰻弧菌在500 L發(fā)酵罐補料發(fā)酵，通氣攪拌培養(yǎng)，10～12 h左右達到生長的最大值，活菌數(shù)可達1.20×1010cfu/mL，活菌數(shù)增加120%以上。