黃惠琴，宋 鑫，劉 敏，胡永華，鮑時(shí)翔*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 海口 571101；2.海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101)

褐藻膠是一種極具應(yīng)用價(jià)值的多糖類物質(zhì)，廣泛存在于褐藻綱的藻類植物中，是細(xì)胞壁的重要組成成分，也部分存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)中[1]。褐藻膠由1,4-β-D-甘露糖醛酸(1,4-β-D-mannuronic acid，M)和1,4-α-L-古羅糖醛酸(1,4-α-L-guluronic acid，G)兩種糖醛酸單體通過(guò)α/β-1,4糖苷鍵鏈接，隨機(jī)排列成線性高分子，無(wú)分支和側(cè)鏈[2]。兩種糖醛酸單體以不同的組合模式共同構(gòu)成多聚古羅糖醛酸(pG)、多聚甘露糖醛酸(pM)以及G與M隨機(jī)聚合成的雜合片段(pGM)。褐藻膠可降解成2～20個(gè)單糖聚合而成的寡糖片段，表現(xiàn)出多種生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3-5]。常用的褐藻膠降解方法有物理降解法(輻射法)、化學(xué)降解法(酸解法、堿解法和氧化法)和生物降解法(酶法和產(chǎn)酶微生物發(fā)酵)，目前工業(yè)生產(chǎn)主要以物理降解法和化學(xué)降解法為主。生物降解法以其專一性高、反應(yīng)條件溫和以及褐藻寡糖得率高等優(yōu)點(diǎn)，受到越來(lái)越多的關(guān)注。褐藻膠裂解酶是一類多糖裂解酶，通過(guò)β-消去反應(yīng)能夠降解大分子褐藻酸生成低分子量的褐藻寡糖或單糖。自然界中褐藻膠裂解酶來(lái)源廣泛，主要來(lái)源于海洋藻類、動(dòng)物和微生物等，其中海洋微生物是產(chǎn)生褐藻膠裂解酶的主要類群[5-6]。微生物中又以細(xì)菌產(chǎn)酶能力強(qiáng)且研究較多，如弧菌(Vibrio)[7]、假單胞菌(Pseudomonas)[8]、鹽單胞菌(Halomonas)[9]、克雷伯氏菌(Klebsiella)[10]、芽胞桿菌(Bacillus)[11]和黃桿菌(Flavobacterium)[12]等。本研究從海洋樣品中篩選能降解褐藻膠的芽胞細(xì)菌，對(duì)酶活較高的菌株HB12274通過(guò)形態(tài)學(xué)和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行了鑒定，并測(cè)定了其降解褐藻膠和馬尾藻的能力，為褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)和工業(yè)應(yīng)用提供了新的來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 海泥樣品采集于海南省東寨港紅樹(shù)林區(qū)，馬尾藻及其所在生境底泥樣品采自海南省儋州市海頭鎮(zhèn)沿海區(qū)域。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 分離培養(yǎng)基：添加0.5%海藻酸鈉的2216E固體培養(yǎng)基(青島海博生物生物技術(shù)有限公司)；檢測(cè)培養(yǎng)基：褐藻酸鈉5，(NH4)2SO45，K2HPO42，NaCl 15，MgSO4·7H2O 1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，瓊脂18，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基：同分離培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器 藻酸鈉、2×EsTaqMasterMix購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。16S rDNA引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(SP-756PC，上海光譜儀器有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(TP600，大連TaKaRa公司)，3D數(shù)碼顯微鏡(Smartzoom 5，德國(guó)Zeiss公司)，恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZHWY-2112B，上海智城分析儀器制備有限公司)，冷凍離心機(jī)(5804R，德國(guó)eppendorf公司)，金屬恒溫浴(MK2000-2E，杭州奧盛儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 芽胞桿菌的分離 稱取10 g樣品(馬尾藻用無(wú)菌剪刀剪碎)，置于裝有90 mL無(wú)菌水及玻璃珠的250 mL錐形瓶中，200 r/min振蕩30 min，使樣品分散均勻。取上清進(jìn)行10倍梯度稀釋，80 ℃水浴處理15 min后，取0.1 mL涂布于分離培養(yǎng)基，將平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2～5 d。挑取生長(zhǎng)好、形態(tài)不同的菌落進(jìn)行劃線純化。

1.2.2 產(chǎn)酶菌株的篩選 ①初篩：挑取單菌落點(diǎn)接于初篩平板，30 ℃培養(yǎng)3 d后，以95%酒精覆蓋平板使其顯示水解圈，以水解圈直徑(D)和菌落直徑(d)比值(D/d)作為初篩指標(biāo)[13]。②復(fù)篩：選取生長(zhǎng)好、水解圈明顯的菌株，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。離心，取上清液作為粗酶液，采用DNS法進(jìn)行褐藻膠裂解酶酶活測(cè)定[14-15]。定義在最適反應(yīng)溫度下，單位時(shí)間內(nèi)將底物水解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

1.2.3 芽胞桿菌的鑒定 ①形態(tài)與生理生化特征：觀察活性菌株在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，用光學(xué)顯微鏡觀察菌體顯微形態(tài)。生理生化特征鑒定參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。②16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析：采用成都福際生物技術(shù)有限公司的Bacterial DNA Isolationg Kit試劑盒提取基因組DNA。16S rDNA擴(kuò)增引物為P1 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′) 和P6 (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′)，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[17]。測(cè)序由生工生物工程(上海)有限公司完成。將測(cè)序結(jié)果在EzTaxon server數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知的模式菌株序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析[18]，使用MEGA5.0軟件中的Clustal W進(jìn)行多序列匹配排列，使用Kimura 2-Parameter Distance模型計(jì)算進(jìn)化距離，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展數(shù)(Bootstrap)設(shè)置為1 000[19]。

1.2.4 粗酶液降解效果測(cè)定 將活化的菌體接入種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，以3%接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。取發(fā)酵液，離心，以上清液作為粗酶液。配制2%的褐藻酸鈉溶液，加入20%的粗酶液，反應(yīng)溫度30 ℃。反應(yīng)2、6、10、14、20、32、48 h時(shí)分別取溶液5 mL，加3倍體積的無(wú)水乙醇，去沉淀，取上清液冷凍抽干，以微量水溶解后進(jìn)行薄層層析(TLC)。展開(kāi)劑為正丁醇∶甲酸∶水=4∶5∶1，用5%的硫酸乙醇作為顯色劑，110 ℃下保持10 min顯色[20]。

1.2.5 馬尾藻藻體降解效果測(cè)定 取新鮮馬尾藻藻體，從藻體上摘取表面潔凈、完整、生長(zhǎng)良好、大小均一的葉狀體，浸泡在0.1%升汞溶液中表面消毒5 min，用無(wú)菌水浸洗6～7次，將殘留的升汞完全洗凈。在芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基加入預(yù)處理后的葉狀體，按3%的接種量接種芽胞桿菌種子液。置于30 ℃振蕩培養(yǎng)5～7 d。顯微鏡下觀察藻體的降解情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

以添加0.5%褐藻酸鈉的2216E培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基，對(duì)經(jīng)80 ℃水浴處理15 min的樣品進(jìn)行芽胞桿菌分離。將生長(zhǎng)的單菌落點(diǎn)接在初篩平板上，95%酒精處理后顯現(xiàn)出明顯水解圈的為產(chǎn)酶活性菌株，其中水解圈與菌落的直徑比值D/d≥5的有16株(圖1)。

將16株活性菌進(jìn)行液體發(fā)酵，采用DNS法測(cè)定其褐藻膠裂解酶酶活，其中菌株HB12274酶活較高，為2.22 U/mL。

圖1 95%酒精處理后顯現(xiàn)出褐藻膠裂解酶水解圈Fig.1 Transparent hydrolysis circle by 95% alcohol staining

2.2 產(chǎn)酶芽胞桿菌HB12274的鑒定

2.2.1 培養(yǎng)及形態(tài)特征 菌株HB12274在分離培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落直徑3～5 mm，圓形，邊緣不規(guī)則，表面無(wú)光澤，乳白色，不透明，菌體長(zhǎng)桿狀，革蘭陽(yáng)性，產(chǎn)芽胞，一端膨大。

2.2.2 生理生化特征 菌株HB12274可在pH 6～11(最適pH 7～8)、16～45 ℃(最適30～37 ℃)、NaCl濃度0%～10%(最適1%～3%)條件下生長(zhǎng)。具體生理生化指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 菌株HB12274生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain HB12274

注：“+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性；“S”表示生長(zhǎng)緩慢

2.2.3 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 經(jīng)測(cè)定獲得長(zhǎng)度為1 406 bp的16S rDNA序列，GenBank登錄號(hào)KU529689。將序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知模式菌株進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果與Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum序列相似性最高，達(dá)到99.8%，與Bacillusmethylotrophicus和Bacillussiamensis序列相似性分別為99.8%和99.7%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中菌株HB12274與Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum聚在同一支，親緣關(guān)系最近(圖2)。

2.2.4 鑒定結(jié)果 菌株HB12274與模式菌株Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum的16S rDNA序列同源性最高(99.8%)，且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚在同一分支，親緣關(guān)系最近；除了Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum產(chǎn)生氧化酶、硝酸鹽反應(yīng)陰性、不能利用阿拉伯糖以外，兩者其他生理生化特征和培養(yǎng)特征、菌體形態(tài)特征基本一致[21]。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株HB12274初步鑒定為解淀粉芽胞桿菌植物亞種(Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum)。

2.3 粗酶液降解效果測(cè)定

以菌株HB12274發(fā)酵上清液作為粗酶液，對(duì)海藻酸鈉進(jìn)行降解試驗(yàn)。采用TLC法對(duì)褐藻寡糖進(jìn)行檢測(cè)，以葡萄糖、L-古羅糖醛酸三糖、L-古羅糖醛酸五糖為參照，從圖3可初步得出，30 ℃降解20～36 h時(shí)主要降解產(chǎn)物聚合度在1～7之間(TLC法能展開(kāi)的最大寡糖為七糖)。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株HB12274系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of strain HB12274g

圖3 褐藻寡糖的TLC檢測(cè)

樣品1為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品2～8分別為第2、6、10、14、20、36、48小時(shí)的酶解樣品

Sample 1 was standards; Samples 2-8 were the enzymatic hydrolysis products for 2,6,10,14,20,36 and 48 h,respectively

圖4 菌株HB12274降解后的馬尾藻葉狀體

A～C：降解前葉狀體的表面、邊緣及毛窠結(jié)構(gòu)；D～G：葉狀體邊緣出現(xiàn)破損；F～I(xiàn)：毛窠結(jié)構(gòu)消失，葉狀體出現(xiàn)破損；箭頭處分別為降解的皮層細(xì)胞和長(zhǎng)方形的髓細(xì)胞

A-C： Surface、edge and hair socket structure of the frond before degradation; D-G： Damaged edge of the sargassum frond; F-I： The disappearing hair socket and the demaged frond；The arrow showed the degraded cortical cells and rectangular myeloid cells

2.4 活性菌株對(duì)馬尾藻葉狀體的降解

將菌株HB12274接入含馬尾藻葉狀體的發(fā)酵培養(yǎng)基，共同培養(yǎng)7 d，取出后放入鋪有潮濕濾紙的平皿中(防止觀察過(guò)程中葉狀體脫水而影響其結(jié)構(gòu))，用3D數(shù)碼顯微鏡觀察葉狀體的表面結(jié)構(gòu)。通過(guò)與降解前的葉狀體對(duì)比，可以明顯觀察到葉狀體被降解，表面變得不平整，表皮層細(xì)胞、皮層細(xì)胞和髓細(xì)胞均被不同程度降解破壞。降解可從葉狀體的任意位置發(fā)生，如葉狀體表面、邊緣、中肋以及毛窠處(圖4)。

3 討 論

芽胞桿菌是一類需氧或兼性厭氧細(xì)菌，能產(chǎn)生多種胞外酶，如褐藻膠裂解酶、纖維素酶、蛋白酶等，同時(shí)能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子，是常用微生態(tài)制劑之一。近年來(lái)我國(guó)在產(chǎn)褐藻膠裂解酶芽胞桿菌方面的研究越來(lái)越多，劉玉佩[22]對(duì)分離的Bacilluscereus開(kāi)展了產(chǎn)酶優(yōu)化，酶活可達(dá)6.4 U/mL，克隆了1 035 bp的褐藻膠裂解酶基因algl，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)的研究；海濱芽胞桿菌BacilluslitoralisM3在pH 7.0、50 ℃時(shí)酶活可達(dá)33.74 U/mg，在海藻降解發(fā)酵方面顯示了應(yīng)用前景[23]；孫媛霞課題組[11]從腐爛海藻中分離到1株芽胞桿菌新種BacillusweihaiensisALg07，能產(chǎn)生新型褐藻膠裂解酶AlgA，其比酶活高達(dá)8 306.7 U/mg，是目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高水平，并從基因組和轉(zhuǎn)錄組水平解析了其降解褐藻的分子機(jī)制。國(guó)外在產(chǎn)酶芽胞桿菌方面的報(bào)道較少，Tavafi等[25]從土壤中富集篩選到Bacillussp.TAG8，產(chǎn)生一種新的褐藻膠裂解酶，可有效降解polyM、polyG以及乙?；暮Ｔ逅釟埢?。

褐藻膠裂解酶活性的測(cè)定方式，可分為定性測(cè)定和定量測(cè)定。定性測(cè)定包括唯一碳源生長(zhǎng)法和平板鑒定法，前者是以褐藻膠為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)酶菌株，觀察微生物是否生長(zhǎng)或液體培養(yǎng)基的黏稠度是否下降，初步判斷是否具有產(chǎn)酶活性。本研究采用平板鑒定法，待微生物在添加褐藻膠的平板上生長(zhǎng)2～3 d形成明顯菌落后，使用95%乙醇試劑處理，會(huì)在培養(yǎng)基上形成水解圈。理論上酶活性越高，水解圈越大，水解圈與菌落直徑的比值(D/d)一定程度上能反映酶活力的大小。定量測(cè)定褐藻膠裂解酶活力的方法比較多，其中硫代巴比妥酸法(TBA)、紫外吸收法(UV)、3,5-二硝基水楊酸法(DNS)和黏度法最為常用。本研究選用DNS法，利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值OD520，再根據(jù)公式便可計(jì)算出反應(yīng)體系中褐藻酸裂解酶的酶活。為排除褐藻膠在高溫條件下釋放具有還原末端寡糖片段的影響，可以采取控制沸水浴時(shí)間、設(shè)置合理空白對(duì)照的方法，設(shè)定沸水浴時(shí)間3 min，將粗酶液、反應(yīng)底物和DNS試劑一同加入試管中進(jìn)行沸水浴，作為測(cè)定吸光值時(shí)的空白對(duì)照，可在最大程度上減少褐藻膠高溫自溶對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[9]。菌株HB12274褐藻膠裂解酶原始酶活雖僅為2.22 U/mL，但該菌株同時(shí)具有纖維素酶和淀粉酶活性，在對(duì)海藻酸鈉和馬尾藻葉狀體的降解實(shí)驗(yàn)中，也顯示出明顯的降解活性，表現(xiàn)出其在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用前景。下一步將對(duì)該菌株進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵優(yōu)化，擬對(duì)其產(chǎn)酶能力進(jìn)行提高。